Inmunología y Microbiología

Fecha: 01/01/2022

Resumen:Nuestro grupo de trabajo desde hace unos años se encuentra caracterizando un conjunto de nanopartículas (Np) con diferentes propiedades aplicables en el campo de la nanomedicina. En particular, nos interesa un grupo de nanopartículas que mostraron propiedades adyuvantes pro-Th1 generando la producción de anticuerpos específicos IgG2a y la secreción de IFN-γ en células T CD4 y CD8 y por lo tanto en este proyecto planteamos su empleo en el diseño de vacunas mucosales y sistémicas. Para el desarrollo de una vacuna preventiva para enfermedades respiratorias, el grupo ha evaluado al sistema nanopartícula-antígeno y hemos observado que cuando es administrado por vía intranasal, esta vacuna alcanza los tejidos necesarios para montar una respuesta inmune. Además, el empleo de modelos animales transgénicos que permiten diferentes infecciones pulmonares nos permitirá estudiar la eficacia de la vacuna para la protección de la infección. Por otra parte, hace unos años nuestro instituto comenzó estudios sobre la inflamación intestinal crónica como estadio inicial del cáncer de colon, A partir de los resultados preliminares obtenidos con el empleo de las nanopartículas como adyuvante, nos proponemos evaluar una inmunoterapia basada en la administración de las nanopartículas cargadas con antígenos tumorales, las cuales son capaces de inducir como mecanismo inmune efector protector una respuesta citotóxica mediada por LT CD8+. Es sabido, que los linfocitos T citotóxicos (CTL), cumplen un rol fundamental en la respuesta antitumoral, induciendo la muerte de las células malignas mediante la inducción de apoptosis. La infiltración del entorno tumoral por las CTL permite el reconocimiento de las células diferenciadas por reconocimiento de péptidos tumorales en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad tipo I. Para el estudio de ambas vacunas se emplearán modelos animales. Para la optimización de la vacuna intranasal, se evaluarán diferentes protocolos de inmunización (cantidad de proteína, dosis de la vacuna, número de administraciones, frecuencia, etc.) en ratones Balb/c y se evaluarán diferentes parámetros inmunológicos (respuesta humoral, celular, mucosal y memoria residente) y ensayos que permitan caracterizar su seguridad e inmunogenicidad. Mientras que para el estudio de inmunoterapias anti-tumorales se emplearán los modelos animales de tumores singenéicos, los cuales consiste en la inoculación de líneas celulares por vía subcutánea, para la inducción del tumor y luego serán evaluadas diferentes inmunoterapias mediante el uso de las Np. Respecto de la vacuna intranasal se están evaluando diferentes formulaciones, obteniendo hasta el momento resultados preliminares promisorios (aumento de IgG, IgA y LT CD8 productores de IFN-). Mientras que, respecto a los modelos tumorales, logramos optimizar el modelo animal en nuestro laboratorio.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:La alergia alimentaria (AA) es una condición inflamatoria crónica común caracterizada por reacción de hipersensibilidad a ciertos alimentos, como a ciertas proteínas a la leche de vaca (PLV), encontrando un perfil Th2 aumentado. Se dispara por la ingesta de antígenos dietarios derivando en desórdenes gastrointestinales, urticaria, entre otras, variando en severidad. La prevalencia de la AA a PLV mediada por IgE en la infancia y niñez temprana ha sido estimada en un 2-3% alrededor del mundo. Se ha descrito que la filogenia en niños alérgicos predominan Firmicutes, Ruminococcaceae, y Lachnospiraceae, y se encuentran reducidos los grupos de Bacteroidetes, Proteobacterias y Actinobacterias, mientras que en niños saludables predominan Lactobacillales, Bifidobacteriales y Enterobacteriales. En previas investigaciones, detectamos que la población bacteriana en muestras de heces de 9 niños sin patologías intestinales presentó alta abundancia relativa en Bacteroidetes, Firmicutes y Bifidobacterium.Bajo la hipótesis de que la microbiota intestinal en pacientes con AA tiene una composición diferencial con respecto a un individuo no alérgico y puede interferir en la activación del sistema inmune local y sistémico, propusimos como objetivo estudiar la composición de la microbiota en heces de niños con AA y pólipos y comparar con la de pacientes alérgicos sin pólipos y con la de niños sin AA. Se extrajo ADN genómico de las heces (recolectadas en tarjetas de detección de sangre oculta en materia fecal HEM-CHECK1) mediante el kit comercial QIAampPowerFecal DNA Kit (Qiagen). El ADN eluido se conservó a -80°C. Se enviará a amplificar un fragmento del gen 16S rARN a partir de ADN usando los cebadores para las regiones flanqueantes V3 y V4, con adaptadores apropiados para la pirosecuenciación. Las amplificaciones se realizarán utilizando sistemas comerciales (FastStart High Fidelity PCR system, Roche Applied Science). Los amplicones de las réplicas se secuenciarán con la plataforma Illumina, garantizando 200.000 lecturas (~300 bp) por individuo para la identificación taxonómica. El procesamiento de las secuencias: el curado, formación de contigos, definición de grupos taxonómicos, clasificación de los mismos y el análisis de las secuencias resultantes se harán utilizando el programa Qiime2, diferenciando la distribución de filum de comunidades microbianas entre niños saludables y alérgicos con y sin pólipos. A partir de los resultados preliminares obtenidos, ampliamos el número de muestras de heces para tener una muestra más representativa de la microbiota de niños saludables de la ciudad de La Plata y con AA a PLV que asisten al Hospital de Niños Sor María Ludovica, para poder comparar y describir las diferentes poblaciones bacterianas con mayor precisión. Proponemos a futuro, describir la microbiota presente en pólipos de niños con alergia a la leche de vaca y compararla respecto a biopsias.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:El cáncer colorectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más frecuente y la segunda causa de muerte por cancer a nivel mundial. La reducción de la mortalidad depende de la detección temprana de pólipos y su consecuente remoción. El CCR se gesta a partir de la acumulación de alteraciones genéticas que interfieren con el control de la proliferación celular. En el intestino, las células activadas debido a la inflamación crónica (aún la que se cursa de manera subclínica) amplifican las señales producidas en respuesta a los microorganismos y los agentes físicos y químicos del ambiente y provocan la destrucción y reparación del tejido. Estos mecanismos, al estar activados continuamente, alteran el tejido, inducen la regeneración tisular y generan un entorno que favorece la transformación cancerígena. Nuestra hipótesis es que la inflamación persistente de bajo grado en la mucosa intestinal ejerce un efecto protumoral por la alteración de las células del compartimiento epitelial y que es posible, mediante distintas estrategias, modular la inflamación para prevenir la formación de tumores. En esta oportunidad, mostraremos los avances en el primer objetivo de la tesis: evaluar la capacidad de inhibición de la carcinogénesis del tratamiento con levaduras probióticas (Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 -Km 8154-), que pueden modular la inflamación intestina, en un modelo murino de cáncer asociado a colitis. Realizamos dos ensayos de una dosis única intraperitoneal de AOM (10 mg/kg de peso de ratón), un carcinógeno, y 4 ciclos de 5 días de DSS 2.5%p/v en agua de bebida para generar la colitis, seguido de 16 días de descanso. A todos los animales se les administró gelatina cada 48 horas. En los grupos con Km 8154, la gelatina era preparada con una suspensión de levaduras de DO 10-30. Se dividieron los animales en 4 grupos: Agua/Control - Agua/Km 8154 - AOM+DSS/Control - AOM+DSS/Km 8154. Se monitoreó su peso y estado clínicos diariamente. Al finalizar los ensayos, cuantificamos los pólipos en colon y tomamos muestras de distintos tejidos para su inspección histológica. También medimos distintos parámetros para evaluar el estado inflamatorio de los animales al momento del sacrificio. Se observó un descenso de peso en todos los grupos con AOM+DSS a partir del cuarto día de la administración de DSS que se recuperaba a partir del 3-4 día de agua. Se observaron pólipos de tamaño macroscópicos a lo largo de todo el colon en los dos grupos tratados con AOM+DSS, con un menor número (plt;0.05) en el grupo que recibió AOM+DSS/Km8154. El análisis histopatológico de las muestras de colon distal informó que se obtuvieron distintos tipos de lesiones: metaplasias, adenomas y carcinomas. Hasta ahora, podemos concluir que pusimos a punto el modelo de cáncer de colon asociado a inflación crónica. Vemos una disminución en la inflamación y en el número de pólipos, restando evaluar el efecto de la levadura a mayores dosis y aspectos mecanísticos asociados al efecto observado.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:Las alergias alimentarias (AA) son patologías inflamatorias en las que el sistema inmune se activa en forma aberrante frente a sustancias inocuas y se postula que se debe a un desbalance entre poblaciones de linfocitos T efectoras (Th2) y regulatorias. Hasta el momento, el único tratamiento válido y aprobado para la mayoría de las AA es la restricción dietaria, pero esta opción sólo elimina el estímulo inflamatorio y no corrige el defecto inmunológico de base. La inmunoterapia sublingual (ITSL) constituye una variante altamente promisoria como tratamiento correctivo de las AA. La principal ventaja es que requiere bajas dosis de alérgeno para inducir tolerancia, y esto reduce los efectos adversos en comparación con la IT Oral, sin embargo, hasta el momento se ha demostrado que resulta menos eficiente. El empleo de agonistas de TLR capaces de inducir una inmunidad Th1-dependiente ha permitido revertir los mecanismos Th2-dependientes que gobiernan las alergias IgE-mediadas. Sobre la base de estos hallazgos planteamos que la administración mucosal de un adyuvante pro-Th1, como son las Nanopartículas (Np) serán de utilidad para desviar la respuesta alérgica, sentando las bases experimentales para el desarrollo de una inmunointervención basada en inmunomodulación. La caracterización de las Np como adyuvante se realizará mediante ensayos in vitro, utilizando distintas líneas celulares tanto murinas (J774) como humanas (THP-1), las cuales se estimularán en presencia de las Nps y se caracterizará la respuesta mediante la medición de citoquinas secretadas por ELISA de captura (IL-1β, TNF-α, IL-6, etc.), o activación mediante citometría de flujo (MHC clase II, CD80, CD86, etc). Para estos ensayos se probarán Np de carga positiva y negativa a diferentes dosis. Se seleccionará la Np que presente una buena activación a dosis bajas, para luego emplearla como como adyuvante inmunomodulador en un modelo de alergia a proteínas de leche vaca (PLV) in vivo. Para ello, se inducirá una respuesta Th2 especifica a PLV en ratones Balb/c mediante la administración intragástrica de PLV junto con toxina colérica con una frecuencia semanal. Luego se realizará un del desafío oral con PLV (alérgeno) para demostrar que los ratones fueron sensibilizados. Una vez inducida la alergia, se comenzará con la fase de desensibilización (tratamiento) con la formulación vacunal elegida mediante la administración sublingual Mediante la caracterización in vitro, se demostró que las diferentes Nps empleadas son capaces de activar el sistema inmune, posiblemente a través de la vía del inflamasoma, ya que se encontraron niveles aumentados de IL1β en sobrenadante de cultivo (plt;0,05), los cuales revierten en presencia de inhibidores de la vía. Hasta el momento, podemos seleccionar una Np positiva, la cual induce una robusta respuesta a dosis bajas. Este resultado es muy promisorio para su empleo como adyuvante mucosal donde se requiere de pequeñas cantidades a administrar de la formulación.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:El retículo endoplasmático (RE), además de ser una organela de importancia en diversas funciones celulares, constituye un centro activo de replicación y de protección viral induciendo estrés reticular. Existen 3 proteínas transmembrana PERK, IRE1 y ATF6, que censan y activan la respuesta a proteínas desplegadas (UPR), intentando disminuir dicho estrés. De no ser posible reestablecer la homeostasis celular, la célula es conducida a la muerte celular por apoptosis mediada por la caspasa 12. Dado que esta apoptosis está relacionada con el proceso de replicación y patogenia en una amplia mayoría de virus con genomas ARN, las vías de señalización involucradas en el estrés de RE se han convertido en blancos atractivos para el desarrollo de antivirales selectivos.El siguiente trabajo tiene como objetivo general estudiar la regulación del mecanismo de estrés de retículo y la inducción de la muerte celular por apoptosis como estrategia antiviral para diferentes modelos de virus ARN de importancia veterinaria: virus de arteritis viral equina (VAE), virus de la diarrea viral bovina (VDVB) y virus del distemper canino (VDC). Como objetivos específicos se plantea: (1) Analizar la interacción de los modelos virales seleccionados con las diferentes proteínas transmembrana que median la activación del estrés de retículo: PERK, IRE1 y ATF6. (2) Estudiar la activación de la caspasa 12 inductora de la apoptosis celular inducida por estrés de retículo. (3) Clonar y expresar proteínas virales seleccionadas y analizar su participación en el proceso de estrés reticular y apoptosis celular. (4) Investigar el efecto de la inhibición de los mecanismos en la replicación viral. (5) Evaluar la selección de las diferentes proteínas virales expresadas y/o de las vías de señalización estudiadas como blancos terapéuticos antivirales.Las actividades y metodologías a desarrollar, se seleccionaron las siguientes cepas virales: Bucyrus-VAE, Singer-VDVB y Onderstepoort-VDC. A partir de ellas, se diseñarán primers para levantar genes candidatos y obtener construcciones recombinantes. Tanto con dichas construcciones como cada una de las cepas virales, se transfectarán/infectarán monocapas celulares a partir de las cuales se recolectarán células a diferentes tiempos postinfección. Se prevé la detección por Western Blot de las proteínas activadas PERK, IRE1, ATF6 y caspasa 12 involucradas en la UPR y en la apoptosis inducida por estrés reticular respectivamente. Del mismo modo, se estudiará la expresión de genes BIP, ATF4, ATF6 y caspasa 12, por qPCR y XBP1 spliced y unspliced por la técnica RT-PCR. Finalmente, se procederá a la inhibición de las vías activadas de la UPR y evaluación, por titulación viral, del efecto en la replicación viral en los cultivos infectados.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:La mucosa intestinal presenta un permanente recambio celular acompañado de una alta tasa de muerte en el epitelio. La apoptosis es la vía de muerte celular predominante tanto en situaciones homeostáticas como en el contexto de la enfermedad celíaca (EC), ya que permite la eliminación masiva de enterocitos envejecidos que son extruidos hacia la luz intestinal, manteniendo la integridad de la barrera epitelial, sin provocar inflamación. Sin embargo, otras vías de muerte celular proinflamatorias, como la piroptosis, cumplen un rol crítico en la defensa contra patógenos y si bien han sido estudiadas en diferentes modelos de infección, sus mecanismos son menos conocidos en condiciones no infecciosas. En el contexto de inflamación crónica, como sucede en EC, la muerte celular proinflamatoria, asociada a la liberación de mediadores como IL-1β e IL-18, y especialmente señales de daño (DAMPs) potencia el reclutamiento y la activación de los mecanismos inflamatorios y de daño tisular. Por lo tanto, es importante comprender cómo mueren las células, principalmente las epiteliales en respuesta a la inflamación. El objetivo de nuestro proyecto es estudiar las vías de muerte celular proinflamatorias en un modelo de enteropatía en ratón que permite caracterizar el efecto in vivo de la administración intragástrica del p31-43, un péptido derivado de gliadinas con propiedades proinflamatorias. Este modelo a su vez posibilita estudiar los eventos más tempranos desencadenados en intestino delgado que no han podido ser evaluadas debido a que el material de estudio son piezas de biopsias de pacientes de largo desarrollo con la patología, y caracterizar las vías inflamatorias y de muerte celular involucradas. Para confirmar este mecanismo, utilizamos bloqueos in vivo del inflamasoma con inhibidores selectivos de NLRP3 y caspasa-1, y el bloqueo funcional con un ac anti-IL-1β. De esta forma, demostramos que el bloqueo in vivo de la vía de la piroptosis, impide la inducción de daño mediante el estímulo inflamatorio. Estos estudios permiten mejorar nuestra comprensión sobre la inmunobiología de la mucosa del intestino delgado en situaciones normales y en el contexto de la enteropatía. En especial, permiten comprender mecanismos inflamatorios poco estudiados en condiciones no infecciosas. El conocimiento generado puede tener un alto impacto ya que podría ser utilizado en la prevención y en la implementación de estrategias terapéuticas combinadas que aumenten la eficiencia de los tratamientos convencionales y reduzcan la progresión o severidad de las complicaciones a largo plazo de EC y enfermedades asociadas, así como en otras patologías inflamatorias.