Bioquímica, Genética y Biología Molecular

Fecha: 01/01/2022

Resumen:Las relaciones filogenéticas de las especies del género Temnocephala, sumado a posibles patrones de distribución y especificidad de hospedador, podrían apoyar hipótesis recientes acerca de su diversificación evolutiva (Steenkiste et al., 2013), y explorar los procesos evolutivos que pudieron ocurrir (e.g., dispersión, extinción, cladogénesis, host-switching o duplicación de hospedador, host-sharing o transferencia de hospedador, especiación por vicarianza). Así, las especies de Temnocephala asociadas a especies de Aegla son un excelente modelo para estudiar la biología evolutiva de organismos comensales sobre diferentes niveles: a) Filogenia interespecífica de Temnocephala spp.; b) Biogeografía comparada del taxón comensal y del hospedador; c) Coevolución hospedador-comensal, a través del contraste de las edades de divergencia de las especies de Temnocephala con la de sus hospedadores (Page amp; Charleston, 1998; Hoyal Cuthill et al., 2016). Por tanto, se plantea identificar los procesos filogenéticos y biogeográficos que influyeron en la diversificación del género Temnocephala en sistemas acuáticos continentales de las regiones Andina, de Transición Sudamericana y Neotropical. Para llevar a cabo este planteamiento se realizarán muestreos en áreas que incluyan las regiones Neotropical, Andina y Zona de Transición Sudamericana (Arana et al., 2021). Debido al patrón de diversificación conocido en el género Aegla, se enfatizará en la Región Neotropical. Los Temnocephala spp. y sus huevos serán colectados de sus hospedadores, cuantificados, fijados y conservados para la realización de estudios morfológicos y moleculares.Con el fin de demostrar las hipótesis planteadas: • Las especies de Temnocephala asociadas a especies de Aegla conforman un grupo monofilético, sustentado por evidencia morfológica y molecular. • La estructura filogenética de Temnocephala presenta un patrón de distribución geográfica asociado a la historia hidrogeomorfológica. • La colonización de nuevos ambientes por parte de las especies de Aegla promovió la diversificación de las especies de Temnocephala. • La filogenia de las especies de Temnocephala es congruente con la de sus hospedadores del género Aegla y se explica por eventos de co-divergencia.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:Introducción: La producción caprina a nivel mundial está en expansión, debido a la rusticidad que presentan este tipo de animales para el aprovechamiento de áreas marginales, en las cuales otro tipo de especies pecuarias no podrían producir. En nuestro país, la cabra podría ser una excelente alternativa en la zona patagónica, como así también en el NOA, debido a la presencia de climas secos y recursos forrajeros limitados. Sin embargo, la producción de esta especie se caracteriza por la utilización de recursos genéticos poco conocidos, así como la ausencia de un plan de mejora y conservación de su variabilidad. Es por esto, que urge la implementación de un sistema de caracterización de los recursos genéticos; puede plantearse como el primer paso para comenzar a mejorar las condiciones productivas de los pequeños productores caprinos. Hipótesis: La hipótesis del presente plan de investigación sostiene que el estudio de poblaciones caprinas mediante tecnologías genómicas permite su caracterización genética, así como también la determinación del efecto de la endogamia en los individuos y la detección de genes involucrados en procesos biológicos asociados a las características raciales. Objetivo: El objetivo general del Plan de Tesis consiste en caracterizar de la variabilidad genética en razas caprinas y analizar los niveles de endogamia y sus efectos, utilizando técnicas de genotipado masivo y análisis bioinformáticos mediante diferentes enfoques. Materiales y Métodos: Material animal y kit de extracción de ADN, genotipado de muestras mediante el kit: Illumina® 50K Goat Bead Chip. Luego el análisis de datos de los SNPs será realizado siguiendo los procedimientos estándar de la unidad bioinformática del IGEVET. Finalmente, mediante el software R Studio y paquetes específicos se analizarán los datos en busca de Bloques de Homocigosidad (ROH) y variaciones en el número de copias (CNV), y se concluirá el análisis mediante gen ontology. Actualmente, se realizó la puesta a punto de los diferentes programas bioinformáticos a utilizar para el análisis de los datos genómicos. Conclusión: La utilización de datos genómicos es una realidad hacia la cual se están dirigiendo la mayoría de los programas de mejora. Este tipo de integraciones permiten mejorar la eficiencia de las predicciones realizadas, así como determinar los valores de cría de animales sin fenotipar (Boichard et al. 2015; Pszczola amp; Calus 2016; Schöpke amp; Swalve 2016). Sin embargo, su desarrollo en la especie caprina es aún muy escaso (Stock amp; Reents 2013), existiendo muy pocos países en los cuales este tipo de tecnologías se estén implementando (Carillier et al. 2013; Mucha et al. 2015). Es por ello que desarrollar mecanismos de obtención de datos genómicos para su posterior utilización en programas de mejora es una tarea necesaria en todas las especies de animales domésticos.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:El Síndrome Metabólico (SM) se define por la confluencia de obesidad central, insulino-resistencia, hiperglucemia, hipertensión y dislipemia. Se asocia con una rigidización generalizada del lecho vascular causada, en parte, por la acumulación de calcificaciones arteriales (CA) asociada a una transdiferenciación osteoblástica de células de músculo liso vascular (CMLV). Actualmente no existen estrategias farmacológicas específicas para disminuir la rigidización vascular; sin embargo, uno de los tratamientos más frecuentes para el SM es el uso de fármacos insulino-sensibilizantes como la Metformina (MET), la cual pareciera inhibir in vitro la transdiferenciación osteoblástica de CMLV. El objetivo general del proyecto es evaluar la eficacia de la MET oral para prevenir la predisposición a formar CA en un modelo de SM experimental inducido por Fructosa en ratas y estudiar los mecanismos involucrados.Para ello se utilizarán ratas Wistar macho adultas jóvenes, separadas inicialmente en 2 grupos de igual número: la mitad recibirá agua estéril como fuente de bebida y las demás una solución de Fructosa al 20%. Tras 14 días, se le agregará a la mitad de cada grupo MET 100 mg/kg/día al agua de bebida, continuando así durante 4 semanas adicionales, quedando conformados los grupos: C (sólo agua de bebida), F (20% de Fructosa en agua de bebida), M (100 mg/kg/día de MET en agua de bebida) y FM (Fructosa+MET). Pre-eutanasia se procederá al pesaje de los animales, toma de muestras séricas y, tras la eutanasia, se diseccionarán corazón y grasa visceral para el cálculo de índices corporales y la aorta para la realización de múltiples ensayos.En plasma se evaluarán parámetros metabólicos relacionados al desarrollo del SM como la glucosa, insulina, colesterol, triglicéridos; además de parámetros renales y hepáticos como transaminasas y creatinina. Por otro lado se evaluarán reguladores de biomineralización y el estado proinflamatorio.A partir de las aortas se diseccionarán los cayados aórticos para la realización de ensayos de calcificación ex vivo sobre tejido entero; de las secciones torácica y abdominal se aislarán CMLV para cultivo y determinación de marcadores de transdiferenciación osteoblástica: actividad de Fosfatasa Alcalina, producción de colágeno tipo I y mineralización; además de estudios moleculares como RT-PCR y Western Immunoblot para proteínas marcadoras.Por último, secciones de aorta intactas se incluirán en parafina y se someterán a estudios histológicos con distintas tinciones para evaluación histomorfométrica de parámetros tales como perímetro de luz arterial, espesor de túnicas íntima y media, cuantificación de fibras elásticas, de colágeno y biomineralización; junto con análisis inmunohistoquímico utilizando diversos anticuerpos específicos contra epitopes de moléculas involucradas en el proceso de transdiferenciación osteoblástica.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:Para protegerse del ataque por patógenos, las plantas producen una serie de de péptidos de defensa del huésped o péptidos antimicrobianos (AMPs) catiónicos, los cuales incluyen a las defensinas. Estos péptidos básicos anfipáticos ricos en cisteína poseen una longitud de 45 a 54 aminoácidos y comparten una homología estructural con las defensinas de insectos, moluscos y mamíferos. La actividad de un AMP está específicamente relacionada con sus propiedades fisicoquímicas, las cuales están dadas por la composición de aminoácidos de la cadena peptídica y su distribución. La unión del AMP a la superficie de una célula microbiana conduce a alteraciones celulares mediante diversos mecanismos como: interacción con las membranas celulares produciendo un cambio en sus propiedades, formando poros y/o conduciendo a su despolarización, impidiendo la biosíntesis de biomoléculas extra o intracelulares, desregulando el flujo de iones en las células y produciendo especies reactivas de oxígeno (ROS) e inhibiendo la síntesis de ATP. Se abordará el estudio de defensinas de Silybum marianum, un cardo de la familia Asteraceae, con actividad antifúngica contra Fusarium graminearum. Los objetivos son: diseñar péptidos derivados de las secuencias de las defensinas de S. marianum y obtener mutantes en sitios específicos (relacionados a los de mayor actividad antifúngica); expresar las proteínas en un sistema procariótico, purificarlas y caracterizarlas; y por último estudiar el mecanismo de acción tanto de los péptidos como de las defensinas. Estas moléculas pueden resultar atractivas para su potencial aplicación agronómica, haciendo foco en el diseño racional de potenciales biofungicidas.La metodología de trabajo es sintetizar péptidos químicamente a través de una estrategia de fase sólida FMOC y luego serán purificados por HPLC de fase reversa. Los pesos moleculares se confirmarán mediante ESI-MS. Para clonar las defensinas se utilizarán el plásmido pET302Nt/His y la cepa TOP10 de E. Coli, y se expresará en la cepa Arctic express, ya que coexpresa unas chaperoninas a bajas temperaturas que favorecen el refolding y protegen de hidrólisis. Se purificarán mediante cromatografía de afinidad a Ni+2. Se realizarán ensayos in vitro de inhibición de crecimiento de conidios de F. graminearum y de tiempo de muerte. Se evaluará la producción de ROS como respuesta celular de estrés oxidativo al péptido o proteína y se evaluará la viabilidad celular a través de la exclusión de la sonda ioduro de propidio. Finalmente, mediante el empleo de sistemas modelo de membranas se estudiará la interacción de las defensinas y péptidos sintéticos con monocapas y bicapas lipídicas de distinta composición. Utilizando dicroísmo circular (da información de la estructura secundaria del péptido en solución/unido a la monocapa), microscopía (confocal, SEM, TEM y AFM) y ensayos con liposomas se estudiará el mecanismo de acción y se interpretarán las relaciones estructura-función.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:La diabetes tipo 2 (DT2) se caracteriza por la presencia de insulinorresistencia (IR) asociada a una disminución de la función/masa de las células β. Su manifestación clínica es precedida por un período de disfunción metabólica conocida como prediabetes (PD), caracterizada por una glucemia de ayunas alterada, tolerancia la glucosa alterada (TGA) o la combinación de ambas. La transición de PD a DT2 puede prevenirse hasta un 58% mediante adopción de estilos de vida saludables.Las alteraciones plurimetabólicas de la DT2, ya se manifiestan en el estadio de PD; su patogenia es compleja e involucra diferentes órganos que participan en la disfunción metabólica existente. Tal es el caso del tejido adiposo visceral (TAV) que participa activamente en la regulación de la homeostasis energética. La administración de una dieta rica en fructosa (DRF) durante 3 semanas genera un aumento del estrés oxidativo (EO), de triglicéridos (TG), de ácidos grasos (AG) libres, glucemias basales normales, hiperinsulinemia e IR, leptinorresistencia y TGA. Por lo tanto, es un modelo apropiado y útil para estudiar la transición PD-DT2 y su posible reversión, ya que el reemplazo de la DRF por una dieta balanceada o la administración de un agente antioxidante (ácido α-lipoico) podrían revertir el desarrollo de estas alteraciones. Por lo tanto, el objetivo es determinar en un modelo animal de PD, si el desarrollo secuencial del aumento del EO e IR en el TAV, promueve la expansión hipertrófica de su masa, modifica la relación adipocitos blancos/marrones/beige e inhibe la angiogénesis local. Simultáneamente, verificar la participación de cambios epigenéticos en la patogenia de estas alteraciones y su posible reversibilidad.Para esto ratas macho adultas fueron alimentadas durante 21 o 70 días con: dieta comercial estándar y agua corriente (C21 y C70); misma dieta y agua con fructosa al 10% (DRF21 y DRF70); y DRF durante los primeros 21 días y agua corriente durante los 49 días siguientes (FC). Al finalizar los tratamientos se realizarán determinaciones séricas y pruebas de sobrecarga de glucosa. Además, se extraerán TAV y TAP y se realizarán los siguientes análisis:-estudios histológicos, -composición de AG-niveles de expresión génica de factores adipogénicos y endócrinos-niveles proteicos de mediadores de la cascada de insulina y apoptosis-cambios en el grado de metilación del ADN.Los resultados brindarán información útil para el desarrollo de herramientas y estrategias que permitan disminuir el impacto negativo de la PD-DT2.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:El síndrome metabólico (SM) es un problema de salud pública y se asocia a alteraciones metabólicas: dislipidemia aterogénica, obesidad central, insulino-resistencia e hipertensión arterial, incrementando el riesgo para Diabetes mellitus tipo 2 y enfermedad cardiovascular. La Calcificación arterial (CA) es un proceso patológico que aumenta el riesgo cardiovascular, y que se caracteriza por la pérdida de elasticidad de las arterias y engrosamiento de su pared por la acumulación de hidroxiapatita en la túnica media y/o túnica íntima. Resulta de interés clínico desarrollar estrategias terapéuticas farmacológicas que ayuden a reducir las CA. Nuestra hipótesis de trabajo es que el SM induce un aumento en las CA por un incremento en la transdiferenciación al fenotipo osteoblástico de las células de músculo liso vascular (CMLV), favoreciendo la biomineralización y aumento de rigidez en la pared arterial; este puede ser prevenido por un tratamiento in vivo con Metformina, fármaco utilizado para el tratamiento de pacientes con SM. El objetivo general de este proyecto es evaluar la eficacia de la Metformina para prevenir la predisposición a formar CA en un modelo de SM experimental inducido por Fructosa en ratas, y estudiar los mecanismos involucrados. Para ello utilizamos 20 ratas Wistar macho adultas jóvenes, que fueron separados en una primera instancia en dos grupos de igual número de animales: un grupo recibió una solución de fructosa 20% p/v ad libitum, mientras que el otro recibió agua estéril ad libitum en el agua de bebida. Transcurridos 14 días de iniciado el ensayo y durante cuatro semanas adicionales, a la mitad de cada grupo se le adicionó Metformina (100 mg/kg/día) al agua de bebida, quedando conformados así cuatro grupos experimentales: Control (C), Control + Metformina (CM), Dieta Rica en Fructosa (DRF) y Dieta Rica en Fructosa + Metformina (DRFM). Pre-eutanasia, los animales son pesados y se extrajeron muestras de sangre para el análisis de distintos parámetros (metabólicos, séricos y proinflamatorios). Post-sacrificio, se diseccionó la aorta abdominal para el aislamiento y cultivo de las CMLV. Se evaluó el efecto de los diferentes tratamientos in vivo, sobre la predisposición ex vivo de CMLV a transdiferenciarse hacia un fenotipo osteoblástico. Para ello se cultivaron CMLV de todos los grupos experimentales en medio basal o en medio de diferenciación osteogénico [DMEM con 10% de suero fetal bovino, 5mM β-glicerofosfato y 25mg/L ácido ascórbico] por 7 días, luego se evaluó su grado de trans-diferenciación osteobástica midiendo la actividad de fosfatasa alcalina, producción de colágeno tipo I y mineralización extracelular. A partir de extractos de CMLV de todas las condiciones experimentales, se medirán tanto la expresión génica (por RT-PCR) como la expresión proteica (por Western blot) para así determinar cualitativamente y semi-cuantitativamente el rol de reguladores de la biomineralización en la acumulación de CA del lecho vascular.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:La Diabetes Tipo 2 (DT2) es una enfermedad crónica grave que se caracteriza por una disminución precoz y progresiva de la masa y función de las células β pancreáticas. Previo a su manifestación, existe un periodo de disfunción metabólica denominado prediabetes (PD) caracterizado por una glucemia en ayunas alterada (GAA), tolerancia a la glucosa alterada (TGA) o ambas, donde ya aparecen las complicaciones micro y macroangiopáticas. La administración de una dieta rica en fructosa (DRF) a ratas normales induce múltiples cambios endócrino-metabólicos similares a los encontrados en la PD humana por lo que resulta un modelo muy útil para estudiar la transición de PD a DT2 y su posible prevención/tratamiento. Los animales alimentados 21 días con una DRF desarrollan hipertrigliceridemia, TGA, insulinorresistencia (IR), hiperinsulinemia e hiperleptinemia. Estos cambios se asocian a un aumento del estrés oxidativo (EO) y a una disminución de la masa de las células β por un aumento de la apoptosis. En la PD, el aumento de la secreción de insulina en respuesta a la IR provoca una sobrecarga funcional de las células β y una consecuente activación del estrés del retículo endoplasmático (RE), desencadenando una respuesta compensatoria que intenta reestablecer la homeostasis del RE y, si no lo logra, promueve la apoptosis. El estrés del RE desencadena alteraciones en la vía de señalización de la insulina y una respuesta inflamatoria que contribuirían a promover la disfunción y disminución de la masa de células β. A su vez, se ha demostrado que las modificaciones epigenéticas contribuirían al desarrollo de dichas alteraciones claves en la transición de PD a DT2, sin embargo, no está claro el papel que cumplirían los micro ARNs (miARNs) en este complejo mecanismo.En consecuencia, el objetivo de este trabajo es estudiar el rol del estrés del RE, EO, el proceso inflamatorio y la participación de moduladores epigenéticos (miARNs) en la disfunción de las células β pancreáticas inducida por una DRF. Se evaluará además la prevención del desarrollo de estas alteraciones mediante la administración ip. durante los últimos 5 días de tratamiento, de un agente antioxidante (ácido α-lipoico) y un inhibidor del estrés del RE (ácido 4-fenil butírico o PBA). Para ello, ratas macho normales se alimentarán 21 días con una dieta comercial estándar (C), ó 10% de fructosa en el agua de bebida (DRF), DRF más ácido α-lipoico y DRF más PBA. En los 4 grupos experimentales se estudiarán parámetros séricos y nutricionales, función insular, expresión génica (niveles de ARNm y proteína) de marcadores de estrés del RE, autofagia, enzimas antioxidantes, mediadores de la cascada de insulina, de la respuesta inflamatoria y de las diferentes vías apoptóticas y se identificarán moduladores epigenéticos (miARNs) claves en la falla de la masa/función β. Estos resultados nos permitirán desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para la prevención/tratamiento de la PD y DT2.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:Existen especies vegetales que producen grandes cantidades de proteasas, por lo que resultan interesantes para su uso en biotecnología. El objetivo del presente trabajo fue obtener, purificar y caracterizar peptidasas de bromelias autóctonas (Bromeliaceae) y emplearlas en la producción de péptidos bioactivos a partir de proteínas alimentarias, con el fin de ser evaluados como posibles componentes en alimentos funcionales. Se obtuvieron diferentes extractos crudos (ECs) a partir de frutos y/o ejes de las infrutescencias de Bromelia hieronymi y B. serra, y a partir de hojas de Deinacanthon urbanianum (=B. urbaniana), resultando los ECs de fruto de B. hieronymi los más activos. Si bien el EC de D. urbanianum presentó baja actividad caseinolítica (AC), se observó mediante zimograma una banda activa de pI alcalino. De los ECs de B. serra, el más activo fue el de frutos de maduración intermedia, por lo que fue seleccionado para realizar su caracterización y definir las condiciones óptimas de trabajo. Se identificó que las masas moleculares de las proteasas de B. serra están comprendidas entre 23,3-26,6 kDa. Dichas enzimas son de tipo cisteínico y su rango de pH óptimo es 6,3-9,0. Presentan estabilidad térmica a 23, 37 y 45 ºC (120 min), y se inactivan luego de 10 min a 75 ºC o de 2 min a 100 ºC. La mayor actividad esterásica se obtuvo sobre el sustrato N-α-carbobenzoxi-p-nitrofenil éster de L-Ala, a diferencia de las enzimas de D. urbanianum que mostraron preferencia por el derivado de L-Gln. Mediante purificación parcial con acetona y etanol se observó que, con cuatro volúmenes de ambos solventes, se recupera más del 90% de AC respecto del EC. Al menos 4 bandas proteicas fueron observadas al IEF (pIs entre 8,4 y lt;3,5), siendo la región alcalina la más activa. Se emplearon extractos de B. serra y B. hieronymi para hidrolizar proteínas de lactosuero, caseína y aislado proteico de soja (0-180 min, 45 y 55 ºC), observándose en todos los casos la degradación progresiva de los sustratos. Se determinó la actividad antihipertensiva por el método de inhibición de la ECA y se ensayó la actividad antioxidante (AA) por el método ABTS (original y “quencher”), la técnica del blanqueamiento del β-caroteno y el método ORAC. Los hidrolizados más promisorios fueron separados por exclusión molecular y las fracciones más activas fueron analizadas por espectrometría de masas (ESI-Orbitrap). Se diseñó un protocolo para encapsular hidrolizados de lactosuero con actividad antihipertensiva. Se utilizó almidón natural de mandioca, el cual fue sometido a tratamiento térmico (annealing) para favorecer la formación de complejos de inclusión con los biopéptidos, los cuales serían resistentes a la digestión gastrointestinal (RS5). El material encapsulante fue caracterizado por iodometría y la formación de complejos se estudió mediante SAXS, observándose la presencia de una señal alrededor de los 20º (2ϴ) característica de complejos con amilosa.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:El objetivo de este proyecto es detectar patógenos emergentes y re-emergentes presentes en cerdos salvajes de la Bahía de Samborombón, incluyendo agentes de importancia para la salud humana, para la producción animal o para la fauna silvestre. En este sentido, los patógenos seleccionados para este estudio los dividiremos en virus de importancia para la salud pública tales como Virus de Influenza y Rotavirus; y además, incluiremos la detección de otros agentes de importancia para la producción porcina como son el Parvovirus porcino, el virus de la Enfermedad de Aujeszky, el Circovirus porcino tipo 2 y el virus recientemente descripto denominado Circovirus porcino tipo 3. Dicho objetivo se llevará a cabo en función al plan de control de la población de cerdos silvestres en áreas protegidas (disposición DI-2019-3-GDEBA-DPRNYOATOPDS) preservando de esta forma la biodiversidad y el ambiente. Se pretende que mediante el control de las poblaciones de cerdo silvestres en el ámbito de Áreas Naturales Protegidas de la provincia de Buenos Aires se preserve la biodiversidad y medio ambiente de la región. Asimismo, se pretende detectar patógenos emergentes y re-emergentes presentes en dicha población y evaluar posibles riesgos zoonóticos ante la presencia de agentes de importancia para la salud humana, para la producción animal o para la fauna silvestre. Es, por lo tanto, de sumo interés para las autoridades sanitarias nacionales conocer o estimar la circulación de dichos agentes. Dentro de ellos, los virus ARN y sobre todo los de genoma segmentado encierran el mayor potencial zoonótico dada la alta capacidad de mutación y las posibilidades de recombinación intra e interespecie. Paralelamente, el riesgo de aparición de nuevas infecciones se ve aumentado no sólo para la población porcina sino también para la humana. El objetivo del plan es determinar la situación sanitaria de una población definida y categorizada de jabalíes con respecto a virosis de importancia para la producción porcina, algunas de ellas con potencial zoonótico, pertenecientes a la bahía de Samborombón4Para llevar a cabo este plan se tomarán muestras de sangre, materia fecal y órganos (pulmón, corazón, hígado, intestino, riñón, bazo, tonsilas y linfonódulos)De los órganos, haya o no lesiones macroscópicas evidentes, se tomará un trozo para el posterior análisis histopatológico, además de realizar un homogenato para extracción de ADN y ARN, para la posterior detección de cada agente mediante PCR y RT-PCR, luego se procederá a la amplificación de segmentos para la caracterización molecular. Las muestras de sangre serán centrifugadas para la separación del suero, asi luego se podra hacer estudios para la detección de anticuerpos mediante ELISA y seroneutralizacion.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:La administración tópica de moléculas terapéuticas presenta numerosas ventajas frente a métodos convencionales, pero se ve dificultada por la naturaleza de barrera de la piel otorgada principalmente por el estrato córneo (SC). Los potenciadores de penetración (PP) pueden alterar de forma reversible la organización de los lípidos del SC aumentando su permeabilidad. Sin embargo, la toxicidad asociada a la mayoría de ellos ha estimulado la búsqueda de compuestos más seguros. Los surfactantes, especialmente aquellos derivados de aminoácidos, resultan una opción interesante ya que mimetizan compuestos naturales, poseen baja irritabilidad y toxicidad, y alta biodegradabilidad. Además, al ser obtenidos mediante calálisis enzimatica empleando peptidasas, se usan tecnologías de bajo impacto ambiental en su producción.En nuestro laboratorio se han sintetizado dos surfactantes catiónicos derivados de arginina, Nα-benzoil-L-arginina decil- y dodecilamida, empleando papaina adsorbida sobre poliamida como biocatalizador. Se ha demostrado que los PP, pero no anfifilos sin propiedades potenciadoras de penetración, aumentan la elasticidad y alteran la estructura lateral de membranas modelo de SC (SCM). Estos estudios señalan la existencia de un patrón en el cual las propiedades reológicas de las monocapas lipídicas de SC son determinantes para los fenómenos de permeación de la piel. En este contexto, se investigó la posible aplicación de nuestros surfactantes como PP mediante el estudio de su interacción con monocapas SCM. Se analizó el efecto de estos compuestos en la estructura en el plano y elasticidad de las monocapas a escala macro-, micro- y nanoscópica. Para esto se emplearon distintas metodologías entre las cuales se encuentran: monocapas de Langmuir, BAM y AFM. Además, se construyó un modelo a escala atómica de dinámica molecular (DM) para profundizar el estudio de esta interacción. Tanto los resultados obtenidos mediante el uso de monocapas lipídicas como del estudio por DM mostraron que ambos surfactantes fueron capaces de incorporarse en las membranas SCM, y alterar no solo sus propiedades reológicas sino también estrucurales mediante el desorden de las cadenas lipídicas promoviendo de esta manera un aumento en la elasticidad y reducción del espesor de la monocapa. Además, pudieron alterar la nano-estructura lateral heterogénea de las membranas SC, al relajar y redondear los bordes de los dominios lipídicos. Este comportamiento se asemeja al efecto inducido por varios compuestos anfifilicos empleados como PP, lo cual indicaría que estos surfactantes podrían ser actuar como PP.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:El antígeno leucocitario humano G (HLA-G), es considerado una proteína que actúa como un control inmunológico (CI) local, de expresión restringida en tejidos adultos sanos. Es sabido que distintos tumores expresan dicha proteína, lo que les confiere una estrategia de escape inmunológico. La relación de este CI con la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), convertiría a estas proteínas en interesantes objetivos terapéuticos. Existe una amplia evidencia sobre el efecto de los cannabinoides asociados a la biología tumoral, los que claramente han demostrado tener efectos paliativos (antiemético, estimulación del apetito, etc.) en pacientes con diferentes neoplasias sometidos a quimioterapia. No obstante, el potencial terapéutico de los cannabinoides en la oncología no se restringe a los efectos paliativos mencionados. Diversos trabajos han demostrado sus efectos antriproliferativos, pro apoptóticos, antiangiogénicos y antimetastásicos en diversos tumores, tanto in vivo como in vitro. Al presente, no existen evidencias sobre la posible relación entre la acción de los cannabinoides y la expresión del HLA-G o alguno de sus receptores. Por lo tanto, nuestro objetivo se focaliza en investigar una probable relación y los mecanismos involucrados entre la acción de los cannabinoides y la expresión de HLA-G/ILT-4 asociada a la expresión de otros mediadores de la respuesta tumoral, con el fín de aportar nuevas estrategias en la terapia oncológica. Para el desarrollo de nuestras investigaciones hemos decidido utilizar diferentes metodologías con relación a los objetivos planteados, que se resumen a continuación:1. Evaluar mediante ensayos de viabilidad celular (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio, MTT) las concentraciones subletales de cannabinoides en la línea celular JEG-3 para el diseño de los ensayos experimentales.2. Analizar, en cultivos de JEG-3, el efecto inducido por fitocannabinoides sobre la expresión del IC HLA-G/ILT2-ILT- 4 y de los marcadores tumorales: VEGF-A, VEGF-C, HIF, mediante PCR en tiempo real (qRT-PCR) e inmunohistoquímica (IHQ)3. Analizar la expresión de los receptores de cannabinoides (CB1 y CB2 principalmente) en la línea tumoral JEG-34. Evaluar los probables mecanismos de acción de los cannabinoides mediante la inhibición de sus principales vías de acción (receptores CB1 y CB2 / GPR55, TRPV1/ componentes de las vías de transducción de la señal). Este trabajo de tesis será desarrollado en la Cátedra de Citología, Histología y Embriología de la Facultad de Cs. Médicas de la UNLP en colaboración con el Laboratorio de Investigaciones Asociadas a Neurociencias (LIAN) - FLENI-CONICET (Escobar- Bs. As.). Cabe aclarar que este plan ha sido presentado y aprobado por el Comité de Bioética y Ética de la Investigación de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de La Plata (COBIMED).

Fecha: 01/01/2022

Resumen:La comunicación célula – célula y cascadas de señalización guían procesos fisiológicos, los cuales representan la base para entender procesos de mayor complejidad a lo largo de la evolución. El filo Cnidaria es un grupo de metazoos basales y primer grupo de animales con sistema nervioso. Dentro de este filo, las hidras (Hydrozoa) son un modelo que permite ser cultivado en laboratorio y utilizado para experimentación.Estudios realizados en nuestro laboratorio, han demostrado que Hydra sp. reacciona al neuropéptido de alatotropina (AT) actuando como mioregulador. AT se identificó por primera vez en 1989 en el lepidóptero Manduca sexta, asociado a la estimulación de la síntesis y secreción de la hormona juvenil. Transcritos de este péptido se encontraron principalmente en el complejo corpus cardicum – corpus allatum y cordón nervioso ventral. Posteriormente, se describió el receptor de AT (ATr) como un miembro de la familia de receptores acoplados a proteína G de rodopsina.Si bien en deuterostomados AT y su receptor no están presentes, el mensajero orexina (también conocido como hypocretina) se une a un receptor que guarda una relación estrecha con AT. De hecho, ambos tipos de receptores presentan altos niveles de similitud y se consideran ortólogos. Se ha sugerido que la función ancestral de AT es mioreguladora como sería en el caso de Hydra, sin excluir otras posibles funciones aún no comprobadas. Posteriormente, adquiere función reguladora de desarrollo, en la síntesis de la hormona juvenil como ocurre en el caso de los insectos. Finalmente, la orexina en vertebrados, con importancia en ingesta y regulador del comportamiento alimenticio, regulación del ciclo circadiano, homeostasis, etc. También actúa como mioregulador, sugiriéndose que al igual que como ocurre con AT, esta sería su función ancestral.En Hydra sp. Hemos caracterizazdo fisiológicamente la cascada de señalización activada por la unión de AT a su receptor, demostrando que este mensajero genera un aumento del calcio citosólico a través de la activación de una proteína Gq y canales de calcio voltaje dependientes.El objetivo de esta investigación es demostrar la existencia y realizar la caracterización genética de ATr en Hydra sp. Además, aportar la caracterización genética de aquellas proteínas asociadas a la cascada de señalización y funcionamiento celular como canales de Ca2+ e inositol 3 fosfato.Para conseguir este objetivo, se trabajará con dos especies de Hydra que serán identificadas a nivel de especie a través de marcadores moleculares, Citocromo Oxidasa I (mitocondrial) y la región espaciadora nuclear ITS. De ambas se extraerá ARN total que asegura la expresión genética de las proteínas y así proceder con PCR - retrotranscripción y su posterior secuenciación. Los resultados permitirán realizar un análisis filogenético para estudiar la relación de ATr en la evolución de los metazoos.

Fecha: 01/01/2022

Resumen:La prediabetes (PD) antecede a la diabetes tipo 2 (DT2) y su prevención y/o tratamiento a tiempo puede prevenir o enlentecer su progresión a DT2. Nuestro objetivo es identificar en islotes y leucocitos de ratas con alteraciones semejantes a las de la PD humana (ratas alimentadas con una dieta rica en fructosa [DRF]) aquellos genes que modifiquen consistentemente su patrón de metilación de ADN en islas CpG. De nuestro trabajo surgirán los genes que, si sufriesen los mismos cambios epigenéticos en leucocitos humanos, podrían erigirse en “Marcadores epigenéticos de PD” (MEPD) y ser detectados por un método simple y relativamente económico (PCR) para un diagnóstico precoz de PD. Esto será de gran importancia en “salud pública” ya que permitirá la implementación de estrategias costo-efectivas para la prevención y/o retraso de su progresión a DT2. Utilizamos ratas Sprague Dawley macho alimentadas ad libitum con dieta estándar, divididas en 7 grupos según la bebida ofrecida, los grupos C21 y C70 recibirán agua por 21 ó 70 días respectivamente, los grupos F21 y F70 beberán una solución de fructosa al 10% p/v (F10%) por 21 ó 70 días y el grupo F21C49 consumirá F10% los primeros 21 días y completará los 70 días de tratamiento bebiendo agua. Los últimos dos grupos recibirán las mismas dietas que los grupos F70 y F21C49 con el agregado de un tratamiento antioxidante (ácido α lipoico) los últimos días de tratamiento (grupos F70L y F21C49L). Luego del sacrificio, obtendremos muestra de sangre para extraer ADN y hacer las siguientes determinaciones séricas: glucemia e insulinemia (cálculo del Índice de resistencia a la insulina y función β), perfil lipídico (triglicéridos y colesterol) y ácidos grasos libres y peroxidación lipídica (TBARS). Se realizarán estudios histológicos y morfométricos del páncreas y se aislarán islotes con colagenasa para el aislamiento del ADN, el estudio de la secreción de insulina estimulada por glucosa y la expresión génica (RT-qPCR y Western Blot). Los genes y proteínas que se analizarán serán en su mayoría, genes involucrados en la regulación de la función y masa celular β, apoptosis, angiogénesis, vía de señalización de insulina y leptina y estrés oxidativo de origen mitocondrial. La secuenciación masiva de ADN genómico con bisulfito permitirá el estudio del metiloma y la identificación de MEPD. Se intentará evaluar la posible reversión del aumento de los MEPD luego de haber revertido el cuadro de PD por un cambio en el hábito alimenticio y/o la incorporación del agente antioxidante. A su vez, el grado de metilación de los genes que resulten diferencialmente metilados en los animales con PD serán evaluados en sus leucocitos por un método relativamente sencillo (PCR) con el fin de poder trasladar este conocimiento a los humanos y poder desarrollar un kit de diagnóstico precoz de PD de relativo bajo costo y que permita un diagnóstico rápido de esta enfermedad.