Impacto de la terapia de inmunosupresión en las poblaciones de linfocitos en trasplante intestinal. Estudios en modelos experimentales y en la clínica Autores:Ivanoff Marinoff, Ivana Mariel Fecha: 01/01/2024Resumen:El trasplante intestinal (TI) es una opción en casos de insuficiencia intestinal y fallos en la nutrición parenteral total, siendo el rechazo del injerto la principal complicación, con alta morbimortalidad. Comprender mejor los mecanismos de alorreactividad es clave para desarrollar estrategias de inmunosupresión (IS) de mantenimiento efectivas y de baja dosis. En clínica, el tacrolimus se utiliza como IS, aunque eficaz en el control del rechazo, se asocia a nefrotoxicidad, infecciones oportunistas y neoplasias.En este estudio, realizamos TI alogénicos heterotópicos (donantes Sprague Dawley y receptores Wistar) en dos grupos: sin IS (n-IS, n=5) y con tacrolimus 0,6 mg/kg/día vía subcutánea por 7 días (TAC, n=10). Se tomaron muestras del injerto a los días 4, 7 y 10 postoperatorios (POD) en el grupo n-IS, y a los días 7, 14 y 21 POD en el grupo TAC. La evaluación del rechazo celular agudo se basó en el Score de Wu, y el recuento de eosinófilos en el injerto mediante tinción con Rojo Congo. La expresión génica de IL-13, marcador de infiltrado eosinofílico, se analizó mediante qPCR.Los animales sin IS presentaron un rechazo moderado-severo entre los días 7 y 10 postrasplante, mientras que en el grupo TAC este rechazo alcanzó niveles severos al día 21, sugiriendo que tacrolimus retrasa la progresión del rechazo en al menos una semana. En el grupo TAC, el rechazo mostró una correlación positiva significativa (p=0.0007) con el recuento de eosinófilos, evidenciando un incremento del infiltrado eosinofílico en injertos a medida que avanza el rechazo. En el grupo n-IS no se observó correlación entre la severidad del rechazo y el número de eosinófilos (p=0.1579).La expresión de IL-13 fue significativamente mayor en injertos TAC al día 21, comparado con injertos n-IS al día 10 (Kruskal Wallis p=0.0018, 8.038 ± 2.528 vs 1.059 ± 0.293, media±SEM), sugiriendo una respuesta Th2 predominante. Nuestros hallazgos sugieren que Tacrolimus retrasa la cinética del rechazo agudo y promueve un infiltrado eosinofílico. Profundizar en los mecanismos celulares del rechazo podría ayudar a optimizar terapias inmunomoduladoras, reduciendo así las dosis de inmunosupresores y sus efectos adversos.Compartir:
Producción de la toxina Épsilon recombinante de Clostridium perfringes como alternativa de inmunógeno vacunal Autores:Manfredi, Mauro Joaquin Fecha: 01/01/2024Resumen:El género Clostridium spp., se caracteriza por ser el mayor productor de toxinas entre los distintos géneros de bacterias. Entre las especies se describen las tres toxinas más potentes, que incluyen la neurotoxina tetánica (TeNT) y la neurotoxina botulínica (BoNT), producidas respectivamente por Clostridium tetani y Clostridium botulinum y la toxina épsilon (ETX) de Clostridium perfringens. C. perfringens es un bacilo grampositivo, anaerobio, que forma esporas resistentes al calor, capaz de producir hasta 30 potenciales toxinas que constituyen gran parte de su virulencia. Se han descripto 6 exotoxinas principales, también denominadas "toxinas mayores": toxina alfa (CPA), toxina beta (CPB), toxina iota (ITX), enterotoxina (CPE - por su sigla en inglés: C. perfringens enterotoxin), toxina similar a la de la enteritis necrótica B (NetB) y toxina épsilon (ETX). ETX es una potente toxina formadora de poros producida por los toxinotipos B y D. Se sintetiza inicialmente en forma de protoxina inactiva y se activa mediante clivaje proteolítico en el intestino, causando enterotoxemia, una enfermedad mortal que afecta principalmente a pequeños rumiantes. Por esta razón, la inmunoprofilaxis es el único método eficaz de prevención para evitar las pérdidas económicas. En la actualidad, las vacunas disponibles formuladas como anavacunas, presentan una cantidad excesiva de componentes no específicos que pueden interferir con la respuesta inmune y aumentar el riesgo de accidentes vacunales. Además, la manipulación del microorganismo y la toxina per se implica un alto riesgo biológico, por lo que su producción recombinante sería una alternativa para su uso como inmunógeno. En este contexto, el sistema de expresión en Pichia pastoris es prometedor por su procesamiento post-traduccional similar al de eucariotas superiores, un promotor inducible por metanol y la capacidad de excretar proteínas al medio extracelular. El objetivo de este trabajo fue obtener y caracterizar la proteína ETX en P. pastoris. Para ello, se desarrollaron dos versiones: una truncada (ETXt) y una mutada (ETXmH106P) que produce una proteína atóxica. Luego de amplificar por PCR el fragmento correspondiente al gen etx, ambas versiones fueron clonadas en el vector pGEMt. Verificada la presencia de los insertos por secuenciación, fueron subclonadas en el vector de expresión pPIC9 y con las construcciones obtenidas se transformó la levadura P. pastoris GS115. Posteriormente, se optimizó la expresión en cultivos a baja y alta escala y se evaluará la capacidad antigénica e inmunogénica, analizando la respuesta inmune en un modelo in vivo e in vitro.Compartir:
Desarrollo de vacunas a base de nanopartículas para enfermedades infecciosas y no infecciosas Autores:Bianchi, Daiana Stephanie Fecha: 01/01/2024Resumen:Objetivo generalEl objetivo de este trabajo es la comparación de dos vacunas a base de nanopartículas (Np) y proteínas (ovoalbúmina:OVA), para su uso en un modelo tumoral de melanoma de ratón. Materiales y métodos Ratones machos C57BL/6 fueron inmunizados con dos dosis de Np1-OVA, Np2-OVA o PBS en un intervalo de 14 dias mediante vías combinadas (Intramuscular + subcutánea). En el día 21, los ratones fueron inyectados de forma subcutánea con la línea celular tumoral B16-OVA. Los tumores fueron monitoreados macroscópicamente y los ratones fueron sacrificados cuando el tumor superaba los 1500mm3. Las respuestas inmunes humorales (IgG, IgG1 e IgG2a) y celulares (células T y macrófagos) fueron evaluadas por ELISA y citometría de flujo, respectivamente. ResultadosRatones de los grupos PBS, Np1-OVA y Np2-OVA desarrollaron tumores con un volumen medio de 987,27mm3, 66,05mm3 and 442,16mm3, respectivamente. Encontramos valores mas altos de IgG especifica anti-OVA en los ratones de los grupos vacunados con Np-OVA respecto al grupo control (0,153±0,106 0,856±0,250; 0,761±0,1640; para PBS, Np1-OVA y Np2-OVA, respectivamente (plt;0.05), con niveles aumentados de IgG1 especifica anti-OVA en los ratones vacunados con Np-OVA en comparación con el grupo control (0,186±0,139; 1,583±0,803; 1,569±0,357 para PBS, Np1-OVA, Np2-OVA, respectivamente (plt;0.05).El análisis de la respuesta inmune celular evidencio una frecuencia más alta de células CD4+IFN+ en ganglio linfático drenante de tumor para ratones del grupo Np1-OVA, en comparación con los grupos Np2-OVA y PBS (plt;0.05). El conteo de las células T y macrófagos infiltrantes del tumor mostro diferencias significativas entre los grupos PBS, Np1-OVA, Np2-OVA (células T CD4+ : 128,9±142,8; 10356,1±7216,7; 493,0±437,6; células T CD8+ : 167,2±209,4; 8164,6±8046,6; 828,7±775,9 macrofagos: 161,2±174,1; 5428,2±2483,6; 1084,6±1006,2 respectivamente) (plt;0.05). Nuestros hallazgos demostraron que las nanopartículas son potentes adyuvantes que promovieron respuestas anti-tumorales en ratones vacunados, incrementaron los niveles de IgG anti-OVA en suero, así como células T CD4+IFN+ en ganglio y macrófagos y células T infiltrantes de tumor. En conjunto, la respuesta inmune inducida por las Np de PAH controlaron el crecimiento inducido por la línea B16-OVA de melanoma en ratón. Finalmente, la Np1-OVA funciono mejor que la Np2-OVA para controlar el crecimiento tumoral.Compartir:
Potencial rol de bacterias y hongos en la muerte embrionaria espontánea y masiva Autores:Rivollier, Francisco Fecha: 01/01/2024Resumen:La muerte embrionaria (ME) genera grandes pérdidas económicas en la producción animal, por lo tanto, es relevante profundizar el conocimiento de este evento reproductivo en mamíferos de interés para las ciencias veterinarias. El roedor Lagostomus maximus (vizcacha de llanura) es un excelente modelo de muerte embrionaria, ya que tiene una tasa de ME que supera ampliamente a la de los mamíferos estudiados hasta el momento. En la vizcacha de llanura, la muerte de los embriones en los sitios de implantación (SI) no es aleatoria, sino que siempre ocurre en aquellos con localización craneal y medio, siendo la tasa de muerte embrionaria del 80%. Este tipo de muerte sectorizada y masiva es parte de la biología reproductiva de la especie, lo que implica que este sea un modelo ideal para el estudio del problema mencionado. Inicialmente se informó que el origen de la ME registrada en esta especie no se relacionaba con variaciones morfológicas en los cuernos uterinos o debido a la presencia de agentes etiológicos animados (microorganismos, entre ellos, bacterias y hongos). Sin embargo, mediante diferentes análisis en los cuernos uterinos de hembras no gestantes se determinó la existencia de variaciones morfológicas. Mas aun, estudios posteriores realizados sobre los SI de hembras con gestaciones temprana e intermedia permitieron establecer una relación con las variaciones en los cuernos uterinos de las hembras no gestantes. Desde los estudios iniciales en la década de los 70´ no se realizaron trabajos que intenten relacionar el origen de la ME en la vizcacha con la presencia de microorganismos.Desde hace algunos años, el útero de los mamíferos dejó de pensarse como ambiente estéril, ya que tiene una microbiota (arqueas, bacterias, protistas y hongos) asociada. Aunque la microbiota endometrial es similar entre diferentes especies, no es estable, ya que varía durante el ciclo estral/menstrual y la gestación. La microbiota endometrial mantiene el estado saludable del útero y favorece el desarrollo embrionario/fetal, entre otras funciones. Se sabe que los desbalances en la presencia, diversidad y abundancia de los microorganismos influyen en la fertilidad, por ejemplo, en las especies ganaderas. En algunas de estas especies, que presentaban alteraciones gestacionales, se determinó la microbiota, pero al desconocerse cuál era la microbiota normal ser perdió la posibilidad de comparación. Por lo tanto, identificar la microbiota uterina en condición de salud es imperativo para comprender las posibles complicaciones de la preñez. Mediante técnicas histológicas y microbiológicas se testearán diferentes hipótesis. A partir de los resultados que se obtengan por este trabajo de investigación preliminar se pretende conocer otros potenciales orígenes de la muerte embrionaria en la especie. Por otro lado, relacionar el rol de las bacterias y los hongos como componentes de la microbiota uterina en la muerte embrionaria y el desarrollo normal de los sitios de implantación.Compartir:
Análisis de la capacidad moduladora de la respuesta inflamatoria del tracto gastrointestinal de productos obtenidos por fermentación de una bebida a base de almendras con bacterias ácido lácticas y levaduras Autores:Olaechea, Maite Fecha: 01/01/2024Resumen:La creciente demanda de alimentos saludables estimula la innovación constante en el desarrollo de nuevos productos. Dentro de los alimentos funcionales, los probióticos han adquirido un papel relevante con importantes efectos en la salud del consumidor. Los productos lácteos constituyen las matrices más utilizadas en la elaboración de alimentos con probióticos; sin embargo, en los últimos años ha surgido la necesidad de utilizar alternativas no lácteas como los análogos de leche de origen vegetal. En este contexto, la fermentación de estas bebidas vegetales con bacterias ácido lácticas (BAL) probióticas surge como una opción interesante, ya que permite incorporar microorganismos benéficos que contribuyen además a mejorar el aroma, sabor, textura y vida útil del producto. Sin embargo, dado que estas bebidas pueden contener factores antinutricionales y baja disponibilidad de nutrientes que afectan la viabilidad de las BAL, se propone el uso de cultivos mixtos con levaduras para mejorar el proceso de fermentación en estas matrices.Las enfermedades inflamatorias intestinales han aumentado en incidencia, prevalencia y gravedad en los últimos años y el uso de probióticos ha demostrado ser efectivo en la modulación de la respuesta inflamatoria a nivel intestinal, contribuyendo a aliviar estas patologías con mínimos cambios de estilo de vida.El objetivo general de este proyecto pretende obtener una bebida funcional a base de almendras fermentada con BAL y levaduras aisladas de kefir, con capacidad antiinflamatoria a nivel del tracto gastrointestinal.Para alcanzar el objetivo general, se plantean los siguientes objetivos específicos:· Obtener la bebida a base de almendras y caracterizar su composición química centesimal.· Seleccionar BAL de los géneros Lactiplantibacillus y Lacticaseibacillus que presenten buena capacidad de desarrollar en la bebida a base de almendras al crecer solas y/o en co-cultivo con las levaduras de los géneros Saccharomyces y Kluyveromyces. Se caracterizarán las bebidas fermentadas en cuanto a pH final, ácidos orgánicos por HPLC con columna de intercambio iónico, número de microorganismos viables mediante recuento en agar MRS y agar YGC y viscosidad aparente. Además, se evaluarán las características organolépticas de la bebida como el aspecto y el aroma.· Estudiar en los productos fermentados seleccionados la capacidad de modular la respuesta inflamatoria intestinal utilizando el sistema reportero Caco-2 CCL20:luc en el que el gen de la luciferasa bajo el control del promotor de la quimoquina CCL20 ha sido transfectado en estable en células epiteliales intestinales Caco-2.De este modo, el presente estudio permitirá seleccionar la mejor combinación de BAL y levaduras para obtener una bebida fermentada a base de almendras con capacidad de modular la inflamación a nivel intestinal, contribuyendo a la salud de los consumidores.Compartir:
Identificar y caracterizar población de macrófagos donde se logra establecer exitosamente B. pertussis intracelularmente Autores:Rea, Emilia Fecha: 01/01/2024Resumen:Rea, Emilia; Balero, Dana; Valdez, HACINDEFI (UNLP CONICET La Plata), Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina.Durante las infecciones microbianas los macrófagos (MØ) pueden polarizarse en células activadas clásicamente (M1) o activadas alternativamente (M2). Estudios previos demostraron que los macrófagos M1 exhiben una respuesta bactericida más fuerte contra B. pertussis en comparación con los macrófagos M2. Sin embargo, aunque la supervivencia bacteriana fué mayor en los macrófagos M2, las bacterias viables persistieron en ambos fenotipos en etapas posteriores de la infección. El presente estudio investiga los roles de la toxina pertussis (Ptx) y la toxina adenilato ciclasa (Cya) en la modulación del fenotipo M1 después de la infección.El análisis de citometría de flujo reveló dos poblaciones distintas de macrófagos 48 horas después de la infección: una que expresaba niveles altos de marcadores M1 (CD80, CD40) y niveles bajos del marcador M2 (CD163), y otra con el perfil inverso. Este resultado sugiere que B. pertussis puede conducir un cambio fenotípico de M1 al fenotipo más permisivo M2. Las infecciones con cepas deficientes en Ptx y Cya (Bp-ΔPtx, Bp-ΔCya y el doble mutante Bp-ΔPtxΔCya) confirmaron que ambas toxinas son críticas en esta modulación. Los ensayos de protección con Polimixina B mostraron que la supervivencia intracelular de Bp-ΔPtxΔCya fue significativamente menor que la cepa del tipo salvaje, lo que indica que Ptx y Cya mejoran la supervivencia de B. Pertussis en los macrófagos M1. El análisis microscópico mostró que la infección con la cepa del tipo salvaje condujo a una reducción en la elongación de los pseudópodos asociados con M1, un cambio morfológico menos pronunciado en las células infectadas con las cepas mutantes. Además, la citometría de flujo demostró una reducción en la expresión de CD80 en células infectadas con la cepa del tipo salvaje, disminución que no se observó en las células infectadas con las cepas mutantes. Los estudios de colocalización con el marcador lisosomal Lysotracker, revelaron que las bacterias que sobreviven a las 48 horas post-infección escapan de la vía lisosomal. Estos resultados sugieren que Ptx y Cya facilitan la supervivencia bacteriana al modificar los macrófagos M1 hacia un fenotipo similar a M2 y permitir la evasión de la via lisosomal, destacando el papel crucial de ambas toxinas en la modulación del fenotipo de los macrófagos durante la infección por B. Pertussis.Compartir:
Estudio de los mecanismos de síntesis de IgE, de las poblaciones de linfocitos B de memoria y de la microbiota intestinal en pacientes con alergias alimentarias Autores:Ilid, Manuela Fecha: 01/01/2024Resumen:Dado el aumento de las manifestaciones alérgicas, la severidad de las mismas y la importancia de la IgE como blanco terapéutico, es de gran interés e importancia estudiar los mecanismos responsables de la síntesis, secreción y regulación de esta inmunoglobulina. El principal obstáculo en el estudio de las células B IgE+ humanas radica en la dificultad de detectarlas debido a su baja frecuencia y a que estas células suelen encontrarse en el tejido de origen. Nuestro grupo ha trabajado en el estudio de pólipos juveniles colorrectales (PJs), extirpados como prevención de recidiva, de pacientes pediátricos atópicos que asistieron por proctorragia al Hospital de Niños Sor María Ludovica de La Plata. Los pacientes presentan IgE total elevada tanto en sangre periférica como en pólipos y la mayor parte de ellos muestran también IgE específica a proteínas de leche de vaca, maní y/o soja. Nuestros hallazgos previos han demostrado infiltrados inflamatorios Th2, dominados por células plasmáticas productoras de IgE y eosinófilos sensibilizados. Esto nos permite asociar la condición de atópicos de los pacientes con la presencia de un infiltrado inflamatorio alérgico en la mucosa colónica, y la presencia de centros germinales activos donde hemos demostrado que se sintetiza IgE. A pesar de que no hay evidencias de la diferenciación in vivo de los LB memoria IgE+ humanos, el origen de los mismos puede ser inferido parcialmente a partir del análisis de las mutaciones somáticas, de los productos de recombinación durante el cambio de isotipo y del repertorio de receptores de antígeno o BCR, ambiente propicio otorgado por los centros germinales.Por esto hipotetizamos que durante una respuesta inflamatoria alérgica, la mucosa colónica humana favorece el desarrollo de células B de memoria IgE+ capaces de movilizarse a médula ósea a través de sangre periférica (SP) y a otras mucosas luego de su diferenciación. Para poder evaluar las poblaciones de LB mediante caracterización de marcadores de superficie y análisis de proteínas involucradas en el tráfico celular (receptores de quimoquinas y moléculas de adhesión) se utiliza la citometría de flujo como técnica principal. Para esto diseñamos dos paneles de detección de LBmem IgE+ en lámina propia de PJs y SP utilizando anticuerpos a-CD45 PerCP,a-CD19 V500, a-CD27 APC, a-CD138 PE, a-IgD SB600, el marcador de viabilidad LiveDead violet, a- IgE Bv711 comercial policlonal y el anticuerpo monoclonal humanizado omalizumab A488.Compartir:
Estudio del impacto de levaduras probióticas en distintos modelos de fisiopatología intestinal Autores:Ferreyra Compagnucci, Malena María Fecha: 01/01/2024Resumen:En producción porcina, para obtener más rédito económico se destetan precozmente los lechones para reducir los tiempos de producción. Esto implica que las crías se enfrentan a la siguiente etapa, donde deberán establecerse nuevas jerarquíaS y hay un cambio en la dieta drástico, con un sistema inmune no completamente desarrollado. Este estrés genera inflamación y los mediadores liberados alteran la barrera intestinal por lo que aumenta la susceptibilidad a patógenos y aumentan las diarreas. En consecuencia, el desarrollo de los lechones se ve afectado. Para compensar estos efectos, una práctica común es el uso de antibióticos como promotores de crecimiento. Debido a su aplicación prolongada en dosis bajas, esta práctica ha generado un gran problema de resistencia antimicrobiana. Las bacterias resistentes además de colonizar a los animales se instalan en el ambiente (suelo, aguas) y el problema se perpetua en las siguientes tandas de producción. Bajo el concepto una salud, que integra las nociones de salud humana, animal y del medio ambiente se busca reducir el uso de antibióticos. Actualmente, contamos con normativas que prohíben su uso como promotor de crecimiento. Por lo tanto, es necesario buscar alternativas que permita reducir los efectos del estrés postdeste en lechones para reemplazar los antibióticos.En nuestro grupo venimos trabajando con una levadura probiótica aislada de la leche fermentada Kéfir. Esta levadura tiene propiedades antiinflamatorias que fueron demostradas en modelos in vitro y en modelos murinos de inflamación. Como probiótico es capaz de sobrevivir en el tracto intestinal, resistente al ácido biliar y ácido clorhídrico. Además, esta levadura es capaz de crecer en diversas condiciones de cultivos lo que es conveniente para crecerla a gran escala. Por todos estos motivos nos propusimos probarla como suplemento de cerdas y lechones y evaluar su impacto en la salud intestinal.Nos proponemos evaluar si la levadura (viva o muerta por calor) tiene un efecto sobre la salud intestinal. Trabajaremos con tres grupos experimentales: control, suplementado con la levadura viva o con la levadura muerta. Se suplementará tanto a las cerdas (en las últimas semanas de gestación y durante toda la lactancia) como a los lechones en las primeras semanas postdestete. En el nacimiento se registrará la facilidad de parto, las crías nacidas vivas y su peso. Al destete, evaluaremos el estado de la barrera intestinal viendo la morfología del tejido y realizando ensayos de permeabilidad ex vivo. También analizaremos la diversidad de la microbiota condicionada por la suplementación. En la recría evaluaremos la respuesta a la vacunación y la presencia de anticuerpos contra componentes de la microbiota en suero. Durante todo el ensayo se va a registrar el peso de los lechones, la conversión alimenticia y la ocurrencia de las infecciones. En base a estos parámetros, evaluaremos si la suplementación tiene un efecto sobre la salud intestinal.Compartir:
