Actividades de investigación relacionadas al desarrollo de nanobiomateriales con aplicaciones biomédicas Autores:Blaiotta, Ramiro Manuel Fecha: 01/01/2024Resumen:La vehiculización de principios activos mediante nanopartículas ha demostrado mejorar terapias farmacológicas, gracias a sus propiedades tecnológicas como el transporte hacia sitios específicos, protección ante condiciones fisicoquímicas adversas, y la reducción de dosis y efectos secundarios.Uno de los mayores desafíos recientes para la comunidad científica ha sido encontrar estrategias para detener epidemias como influenza H1N1, Ébola, Zika y SARS-CoV-2. Aunque se han centrado esfuerzos en el desarrollo de vacunas, mejorar las terapias para infecciones virales y bacterianas sigue siendo crítico. Pacientes hospitalizados con infecciones virales y en cuidados intensivos tienen mayor riesgo de contraer infecciones bacterianas multirresistentes (MDR). La nanotecnología surge como una alternativa para enfrentar dichas infecciones, aprovechando las propiedades únicas de las nanopartículas (NP) para controlar la administración de fármacos y mejorar la eficacia de los antibióticos, ayudando a erradicar biopelículas.Las formulaciones basadas en matrices poliméricas, especialmente en quitosano, destacan por su biocompatibilidad y biodegradabilidad. El quitosano, segundo biopolímero más abundante en la naturaleza, posee propiedades físico-químicas que lo hacen ideal para la administración de fármacos y control de infecciones bacterianas, ya que interactúa específicamente con principios activos y permite su localización dirigida en el organismo.Para estas formulaciones se utiliza la técnica de síntesis por nanoprecipitación iónica por goteo, aprovechando las cargas superficiales de los reactivos para ensamblar las nanopartículas. Esta técnica permite obtener un perfil de tamaño, índice de polidispersidad (PDI) y potencial Z en función de la relación de reactivos utilizados.Estas nanopartículas pueden vehiculizar antibióticos y otros compuestos. Por ejemplo, la cefalexina, un antibiótico usado en infecciones del tracto respiratorio, piel, huesos y oídos, y el resveratrol, un compuesto antioxidante natural que se produce en respuesta al estrés en plantas. El resveratrol ha demostrado inhibir el quorum sensing bacteriano, por lo que se presenta como un candidato interesante para trabajar en conjunto con antibióticos.En resumen, las nanopartículas de quitosano son versátiles tanto en su composición como en sus funciones. Por ello, la caracterización de estas nanopartículas y el estudio de su potencial aplicación en terapias personalizadas resulta de gran interés, dado que su síntesis es eficiente en términos de tiempo y costo.Compartir:
Biomateriales implantes para la regeneración de tejido óseo Autores:Vega, Jazmín Fecha: 01/01/2024Resumen:Las cáscaras de huevo constituyen un residuo domiciliario e industrial interesante parasu reaprovechamiento como fuente de colágeno e hidroxiapatita para el desarrollo debiomateriales para la regeneración ósea. El objetivo global del trabajo es obtenercolágeno de tipo 1 para emplearlo como adhesivo natural para mejorar la interaccióncelular con una matriz porosa de quitosano-carboxi metil celulosa, desarrolladapreviamente. En esta primera parte, el objetivo es el aislamiento y caracterización decolágeno tipo 1 a partir de la membrana de la cáscara de huevo.El colágeno fue obtenido a partir de la hidrólisis de las membranas de huevo en0,5%v/v ácido acético a 25°C, bajo agitación a 500rpm durante 10 días. El hidrolizadose filtró y el colágeno se precipitó agregando de sulfato de amonio o cloruro de sodiocon posterior reposo por 24h, luego de lo cual se centrifugó a 10000g. El precipitadose lavó con agua destilada y resuspendió en 0,5M de ácido acético. Las pruebas decaracterización realizadas fueron: contenido total de proteínas por el método deBradford; contenido de colágeno empleando el método de Sirius red; espectroscopíainfrarroja por transformadas de Fourier (FTIR), espectroscopía UV-visible y porelectroforesis en tiras de acetato de celulosa. Se realizaron dos aislamientosindependientes empleando sulfato de amonio (M1) o cloruro de sodio (M2) comoprecipitante. El contenido total de proteínas para M1 fue de 1893 + 64 mg/ml; mientrasque para M2 fue de 1171 + 31 mg/ml. El contenido total de colágeno por muestra fuede 713 + 87 ug/ml para M1 y de 266 + 17 ug/ml para M2. El rendimiento promedioobtenido en la precipitación con sulfato de amonio fue de 22%, mientras queempleando cloruro de sodio fue de 7%. Los espectros UV-visible para las muestraspresentaron una banda de absorción a 273nm. La pureza y estabilidad de la muestrafue estudiada empleando electroforesis en acetato de celulosa, y la identidad porFTIR.En conclusión, nuestros resultados muestran que se pudo obtener, de manera sencilla,colágeno de tipo 1 a partir de membrana óvea. Seleccionamos como método deobtención la purificación con sulfato de amonio por presentar mejores rendimientoscon igual pureza y estabilidad, obteniéndose colágeno de características adecuadaspara la aplicación propuesta. En un futuro se adicionará el colágeno sobre las matricespara evaluar si efectivamente mejora las propiedades de biocompatibilidad de lasmatrices previamente sintetizadas.Compartir:
Modulaciones metabólicas de la expresión y función del canal de protones Hv1 en células T Autores:Finochietto, Paulina Fecha: 01/01/2024Resumen:La reprogramación del metabolismo energético es una característica que distingue a lascélulas tumorales. Este fenómeno conlleva a un incremento en la producción de especies ácidas que deben ser eliminadas de la célula para mantener la homeostasis y prevenir la muerte celular. El canal de protones Hv1 es una estructura de membrana que permite el flujo selectivo de H + desde el citoplasma hacia el espacio extracelular, regulando el pH de las células sin un costo de energía metabólica. Aunque la función de este canal se ha demostrado en varias células del sistema inmune, su rol en las células T no se encuentra totalmente dilucidado. Estudios previos de nuestro grupo demostraron que la inhibición del canal conduce a la acidificación y posterior muerte por apoptosis en células Jurkat, las cueles derivan de una Leucemia Linfoblástica Agudas (LLA-T). Recientemente, se demostró la participación de este canal en la activación de linfocitos T, en asociación con el cambio metabólico que sufren las células durante dicho proceso. Este resultado se suma a reportes previos que demuestran la participación del canal en procesos fisiológicos vinculados al metabolismo como la secreción de insulina y capacitación espermática. En el mismo sentido, nuestro grupo ha demostrado que el canal es capaz de activarse en presencia de ATP, demostrando por primera vez su sensibilidad a intermediarios metabólicos.El objetivo principal de este proyecto es estudiar el rol del canal Hv1 en el metabolismo energético de células derivadas de patologías oncohematológicas de origen T. Para ello, proponemos estudiar los efectos de la inhibición del canal sobre el la función mitocondrial y la vía glicolítica en células Jurakt. Los resultados obtenidos hasta el momento demuestran que el tratamiento de estas células con Cl-GBI (un inhibidor selectivo del canal) altera diversos parámetros asociados a la función mitocondrial en forma dependiente de la concentración y el tiempo de incubación. Entre ellos, se observa una hiperpolarización de la membrana mitocondrial interna, y un incremento en la producción de especies reactivas del oxígeno. Estos efectos, fueron acompañados por una disminución de la viabilidad celular. Por otra parte, la función glicolítica, medida a través de la cuantificación del lactato extracelular, no se vio afectada luego de la inhibición del canal. Para completar estos estudios, proponemos evaluar los efectos de otros inhibidores del canal, como el Zn+2, o su inhibición transcripciónal mediante shRNAs específicos, sobre parámetros vinculados al metabolismo energético de las células Jurkat. Además, proponemos explorar la modulación de las propiedades electrofisiológicas del canal por intermediarios o productos del metabolismo energético mediante la técnica de patch clamp.Compartir:
Aplicación exógena de compuestos naturales como estrategia para controlar el daño por frio en berenjena Autores:Guijarro Fuertes, Michelle Estefanía Fecha: 01/01/2024Resumen:La berenjena puede sufrir daño por frío (DPF) al almacenarse a baja temperatura y conlleva pérdida de calidad organoléptica-nutricional. La aplicación de compuestos naturales como glicina betaína (GB) previo almacenamiento, ha demostrado reducción del DPF en ciertos productos frutihortícolas. El objetivo del trabajo fue utilizar la espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier (FTIR) como herramienta para la detección temprana del DPF en piel de berenjenas control y tratadas con GB. Berenjenas violetas, tamaño comercial, fueron seleccionadas, desinfectadas, divididas en grupo control y tratadas con GB (10 mM). Se almacenaron a 4 °C durante 20 días. Semanalmente (8, 15 y 20 días) se tomaron muestras para evaluar índice de DPF (ID, inspección visual) y capacidad antioxidante (TEAC, espectrofotometría), como referencia. Para la obtención de espectros IR las muestras de piel, fueron congeladas, liofilizadas, trituradas y analizadas en un FTIR-ATR. Cada espectro fue obtenido del promedio de 64 scans, resolución 4 cm-1, rango espectral de 4000- 600 cm-1. El conjunto de espectros resultante fue procesado con el software SIMCA, y se realizó un análisis de componentes principales (PCA). Los frutos tratados se diferenciaron visualmente del control a 20d, presentando un ID significativamente menor. Los compuestos antioxidantes se redujeron durante el almacenamiento pero los frutos tratados presentaron mayor TEAC que el control al dia 20. En cuanto al análisis espectroscópico, el PCA permitió evidenciar la separación de espectros acorde al tratamiento y día de almacenamiento. Las muestras tratadas con GB se diferenciaron del control a partir del día 8 y sus espectros no se modificaron en el tiempo, manteniéndose en grupos cercanos. Al contrario, muestras del grupo control mostraron amplia separación partir del día 8. Estas diferencias resultarían fundamentalmente de la contribución de varias señales, entre ellas las bandas en la región de 800 a 1800 (región de huella digital) caracterizadas por modos vibracionales de deformación de enlaces CH, C–O–C, vibración de C–OH, C=C (anillo aromático), C–C, unión de anillo fenil, C=O (grupo carbonilo) y estiramiento de ión de grupo carboxílico -COO-. Todos ellos de grupos funcionales asociados a antioxidantes característicos de piel de berenjena como ácido clorogénico y antocianina delfinidina. Las señales obtenidas se encontraron en concordancia con los resultados obtenidos espectrofotométricamente para la capacidad antioxidante (TEAC). Además, se determinó una mayor intensidad en bandas asociadas a la delfinidina durante el almacenamiento de frutos tratados respecto al control, relacionándose a la menor decoloración observada en el ID. Los resultados permitieron concluir que GB resulta efectivo para el control del DPF en berenjena y que la espectroscopía FTIR puede ser utilizada para la detección temprana del daño a partir de la identificación de señales espectrales claves.Compartir:
Modulación de canales NaV1.2 por la cepa de Cannabis s. CAT-5 y compuestos aislados Autores:Manzur De Nardi, Agustín Fecha: 01/01/2024Resumen:La humanidad utiliza extractos de la planta Cannabis sativa con fines medicinales desde hace miles de años para tratar diversas patologías, tales como dolor crónico, trastornos del sueño, depresión, epilepsia, entre otros. Sin embargo, debido a su prohibición en la mayoría de los países, no fue hasta hace algunas décadas que se comenzaron a realizar descubrimientos importantes en torno a los mecanismos mediante los cuales puede alterar la fisiología humana. Entre otras cosas, fue descripto que el cannabidiol (CBD), uno de los principales constituyentes del extracto de Cannabis s., genera bloqueo sobre los canales de sodio voltaje operados (NaV), y que este podría ser uno de los mecanismos que aportan al efecto antiepiléptico de los extractos observado de forma empírica. En este proyecto nos proponemos profundizar en el entendimiento de dicho efecto, y más específicamente, investigar si otros componentes del extracto participan en la modulación de canales NaV además del CBD. Utilizaremos la linea celular HEK-293 con expresión estable del canal NaV 1.2, una de las isoformas con expresión mayoritaria en neuronas. Registraremos las corrientes de sodio a través de estos canales, utilizando la técnica de patch clamp. Mediremos las corrientes evocadas antes y después de aplicar distintos tratamientos: (1) diluciones de extracto total de Cannabis s. de la Cepa Argentina Terapéutica 5(CAT5), (2) aceite esencial, conteniendo los principales terpenos y flavonoides, o (3) compuestos purificados tales como CBD y ácido cannabidiólico (CBDA), para luego comparar sus efectos. Se caracterizará el tipo de potencial modulación de estos tratamiento mediante protocolos de corriente-voltaje (IV), inactivación de estado estacionario, recuperación de la inactivación y bloqueo dependiente de frecuencia. Los mismos permiten dilucidar si el compuesto modifica la dependencia de las corrientes con el voltaje, si favorece el pasaje de los canales a su conformación inactivada, si modifican la cinética de recuperación de la inactivación, y si su potencia se modifica según la frecuencia de estimulación. Los resultados de este trabajo permitirán profundizar el conocimiento respecto a las propiedades anticonvulsivas de los extractos de Cannabis s., lo cual en un futuro podría ser de gran valor para la prescripción de tratamientos dirigidos específicamente a distintos tipos de epilepsia, sobre todo para los denominados refractarios, los cuales no responden a los tratamientos convencionales.Compartir:
Búsqueda y diseño racional de inhibidores asistida por computadora orientado al desarrollo de nuevos compuestos con potencial actividad antitumoral: estudio en modelos celulares tumorales 2D y 3D Autores:Quispe Castillo, Patricia Araceli Fecha: 01/01/2024Resumen:Los modos de unión describen la relación espacial y las interacciones químicas entre unligando y su blanco molecular, incluyendo la orientación relativa y las interacciones específicas. La correcta identificación de un modo de unión es crucial para establecer el mecanismo de acción de un compuesto y facilitar la optimización de moléculas líderes en campañas de desarrollo de fármacos.Generalmente, la caracterización de los modos de unión se realiza mediante la inspecciónvisual o el uso de herramientas de análisis que identifican interacciones específicas, como puentes de hidrógeno, contactos hidrofóbicos e interacciones catión-π.Este estudio propone un nuevo enfoque para evaluar la similitud entre los modos de unión de ligandos en el sitio activo de un blanco utilizando el coeficiente de Sørensen-Dice (SDC),comúnmente empleado en el procesamiento de señales. El método se basa en las energías entre pares ligando-residuo estimadas mediante MM/GBSA, lo que permite comparar cuantitativamente la similitud en el modo de unión de dos o más moléculas a un mismo blanco molecular. Cada interacción ligando-residuo se representa mediante una función gaussiana, con una media y desviación estándar derivadas de las energías MM/GBSA observadas durante una trayectoria de dinámica molecular. La similitud entre dos interacciones aumenta a medida que sus distribuciones de energía se superponen. Finalmente, la similitud global de las interacciones entre los ligandos y la proteína se calcula como el promedio de estas similitudes individuales. Un valor cercano a 1 sugiere modos de unión similares, mientras que un valor cercano a 0 indica una mayor diferencia.La quinasa de adhesión focal (FAK) es una proteína implicada en la progresión tumoral,favoreciendo procesos como la angiogénesis, invasión y metástasis, lo que le otorga relevancia como blanco molecular a nivel clínico. En el caso del complejo VO-crisina (VO(crys)2), encontramos una similitud en el modo de unión con la mitoxantrona, un inhibidor que además muestra un patrón de interacción particular en comparación con el resto de los inhibidores clínicos evaluados.Compartir:
Papel de los neuropéptidos CCHamida y sus receptores en la regulación de la diuresis posprandial en el insecto Rhodnius prolixus, vector de la enfermedad de Chagas Autores:Padín Malvetti, Iván Joel Fecha: 01/01/2024Resumen:Rhodnius prolixus es un insecto hematofago obligado capaz de ingerir hasta 10 veces su peso corporal en sangre en un periodo de tiempo acotado. Tras la ingesta de sangre, el insecto requiere un proceso diurético acelerado que involucra factores neuroendocrinos como la serotonina y neuropéptidos específicos. La regulación de la diuresis en R. prolixus implica la acción integrada de los órganos excretores, como los túbulos de Malpighi y el intestino medio anterior, que actúan conjuntamente para ajustar el volumen y composición de la hemolinfa. Estos insectos actúan como vectores del parásito Trypanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad Chagas, a través de la deposición de heces/orina que se eliminan después de la alimentación. Por tanto, el entendimiento de la diuresis como vínculo importante en la transmisión de esta enfermedad y por ende el estudio de los factores implicados en su regulación adquieren gran relevancia en el entendimiento de este proceso vital. El presente proyecto tiene como objetivo estudiar el rol de los neuropéptidos CCHamida y sus receptores en la regulación de la diuresis posprandial de R. prolixus. Estudios previos de nuestro laboratorio han demostrado que CCHamida ejerce un efecto dual: estimula la excreción en túbulos de Malpighi, lo que facilita la eliminación de agua e iones, pero inhibe el transporte de fluidos en el intestino anterior, ejerciendo así un efecto antidiurético sobre este. Esto sugiere que CCHamida permite una modulación precisa de la diuresis, manteniendo la homeostasis del insecto tras la ingesta de grandes volúmenes de sangre. En este trabajo nos propusimos:Caracterizar la expresión de CCHamida y sus receptores en el intestino anterior y túbulos de Malpighi en momentos clave post-alimentación. A través de la técnica de qPCR se evaluarán los niveles de mRNA de cada gen de interés, lo cual permitirá correlacionar los cambios hormonales con las variaciones fisiológicas en la excreción y absorción en estos órganos.Localizar CCHamida a través de anticuerpos específicos para visualizar el neuropéptido en túbulos de Malpighi e intestino anterior, utilizando microscopía confocal. Estos estudios de localización tisular ofrecen una perspectiva sobre la función fisiológica de CCHamida en órganos excretores y permiten relacionar su expresión espacial con los procesos de regulación diurética.Silenciar los receptores de CCHamida mediante RNAi. Se inyectará un RNA de doble cadena (dsRNA) específico en ninfas de R. prolixus de V estadio para reducir la expresión de cada receptor. Luego del tratamiento, se cuantificará la expresión residual mediante qPCR y se evaluará ingesta de sangre y tasa de excreción. Al comparar las respuestas de los individuos silenciados con los controles, se espera obtener información sobre el papel funcional de cada receptor en la regulación de la diuresis.Compartir:
Rol del estrés del retículo endoplasmático, estrés oxidativo y la respuesta inflamatoria en la disfunción de las células β pancreáticas inducida por dieta rica en fructosa: su posible prevención con agentes antioxidantes y chaperonas químicas Fecha: 01/01/2024Resumen:La administración de una dieta rica en fructosa (DRF) a ratas normales induce cambios endócrino-metabólicos similares a la prediabetes (PD) humana, como hipertrigliceridemia, TGA, insulinorresistencia (IR), hiperinsulinemia e hiperleptinemia, asociados a un aumento del estrés oxidativo (EO) y disminución de la masa de células β por apoptosis. La IR presente en la PD, induce aumento de la secreción de insulina, provocado por una sobrecarga funcional β que activa el estrés del retículo endoplasmático (ERE), desencadenando una respuesta compensatoria para restaurar la homeostasis del RE y, si no lo logra, promueve la muerte celular por apoptosis. El ERE desencadena alteraciones en la vía de señalización de la insulina y una respuesta inflamatoria que contribuirían a promover la disfunción y disminución de la masa β. Modificaciones epigenéticas como los micro ARNs(miARNs) contribuirían al desarrollo de dichas alteraciones claves en la transición de PD a DT2, aunque no está claro el papel que cumplirían en este complejo mecanismo. El objetivo de este trabajo es estudiar el rol del ERE, EO, respuesta inflamatoria y la participación de moduladores epigenéticos (miARNs) en la disfunción de las células β pancreáticas inducida por una DRF. Para evaluar la prevención del desarrollo de estas alteraciones mediante la administración durante los últimos 5 días de tratamiento, de un antioxidante (ácido α-lipoico) y una chaperona química que atenúa el ERE (ácido 4-fenil butírico o PBA). Para ello, ratas normales durante 21 días con una dieta comercial estándar (C), fructosa al 10% en el agua de bebida (DRF), DRF + ácido α-lipoico y DRF + PBA. Se estudiarán parámetros séricos y nutricionales, se aislarán los islotes pancreáticos para medir función insular, expresión génica (niveles de ARNm y proteína) de marcadores de ERE, autofagia, EO, mediadores de la cascada de insulina, respuesta inflamatoria, apoptosis y se identificarán moduladores epigenéticos (miARNs) claves en la falla de la masa/función β. Resultados preliminares muestran que la DRF aumenta los niveles triglicéridos, TBARS, col no HDL e índice de IR y disminuye el col HDL; alteraciones revertidas con la administración de PBA. En ratas DRF presentó TGA que se restableció con el tratamiento con PBA. El grupo DRF registró un aumento de los niveles de ARNm de los marcadores de ERE, autofagia, inflamación y apoptóticos, y una disminución de los niveles de ARNm y de proteina de los mediadores de la cascada de insulina. Todas estas alteraciones se revirtieron con la administración de PBA. La DRF induce un estado de PD con dislipemia, EO, IR, TGA y sobrecarga funcional β con ERE, respuesta inflamatoria y apoptosis, responsables de la disfunción y disminución de la masa de células β. Estas alteraciones fueron revertidas/atenuadas con la administración de PBA, indicando que el uso de chaperonas químicas resultaría una alternativa terapéutica prometedora para prevenir/ retrasar el desarrollo de diabetes tipo 2.Compartir:
Regulación transcripcional y mecanismos de acción de dos factores de transcripción del tipo WRKY implicados en la defensa de tomate contra Pseudomonas syringae pv. tomato Autores:De la Fuente, Yasmín Aylén Fecha: 01/01/2024Resumen:Para detectar y defenderse de los organismos patógenos, las plantas utilizan un sistema que consta de dos fases: PTI (pattern-triggered immunity) cuya activación se da luego de la percepción de MAMPs (microbe-associated molecular patterns) y ETI (effector-triggered immunity). Pst inyecta efectores en células vegetales para contrarrestar sus respuestas y generar cambios metabólicos que favorecen su proliferación en el tejido vegetal. Las plantas resistentes a estos patógenos codifican para proteínas de resistencia que median el reconocimiento de ciertos efectores conduciendo a la activación de la ETI.La activación de la PTI y la ETI llevan a cambios transcripcionales, de los que participan los FT. El análisis de genes candidatos derivados de datos RNA-seq realizados previamente permitió identificar dos FT del tipo WRKY (SlWRKY22 y SlWRKY25), cuya caracterización en N. benthamiana determinó que estos FT son reguladores positivos de la inmunidad contra patógenos bacterianos y no bacterianos. Luego, estudios realizados utilizando tomates mutantes demostraron que modulan el cierre estomático y regulan la defensa contra Pst.Nuestro objetivo general de trabajo es estudiar la participación de estos FT WRKY en la defensa de tomate y evaluar de qué manera participan en la activación de las respuestas inmunes en esta planta. Objetivos específicos:1. Evaluar el metabolismo de hormonas en plantas de tomate doble mutante (Δwrky22/25): se usarán plantas Δwrky22/25 y plantas salvajes Río Grande-PtoR (PtoR). Previamente se vio que estas plantas mutantes, en comparación a PtoR, tenían mayor conductancia estomática, estomas más abiertos en estado basal y que no respondían a estímulos como la oscuridad y el patógeno. Esto sugiere alteraciones en el metabolismo de las principales hormonas que regulan la apertura y el cierre estomático, tales como ácido abscísico, etileno, citocininas, metil jasmonato, ácido salicílico y/o estringolactonas. Para analizar esto, realizaremos diversos tratamientos con hormonas y mediremos sus niveles endógenos. 2. Analizar la posible participación de los WRKYs en la resistencia sistémica adquirida (SAR): se quiere evaluar el estado funcional de la SAR en las plantas mutantes ya que que los análisis previos fueron realizados sólo de manera local. Para esto se infiltrarán plantas PtoR y Δwrky22/25 con diferentes cepas de Pst DC3000 y se determinará su crecimiento bacteriano en el tejido sistémico. 3. Identificar posibles genes blanco de estos FT: para realizar un análisis de los cambios transcripcionales que ocurren debido a la regulación de estos FT, se llevarán a cabo ensayos de RNA-seq comparando plantas PtoR y Δwrky22/25 frente a distintas cepas de Pst. Los datos obtenidos se analizarán en busca de genes diferencialmente expresados. 4. Generar plantas sobreexpresantes de SlWRKY25: generaremos plantas sobreexpresantes estables del WRKY25 de las cuales obtendremos líneas homocigotas para determinar su respuesta frente al patógeno.Compartir:
Estudio del transporte de iones en acuaporinas PIP Autores:González Altieri, Lucía Fecha: 01/01/2024Resumen:Las proteínas PIP (plasma membrane intrinsic protein) son canales tetraméricos localizados en las membranas plasmáticas de las células vegetales pertenecientes a la familia MIP (major intrinsic proteins, también denominados AQP o acuaporinas debido a su función en el transporte de agua). En cada especie vegetal se expresa un gran número de PIPs con muy alta identidad de secuencia. Si bien estos canales presentan un eficiente transporte de agua, en los últimos años se ha demostrado que algunas PIP podrían funcionar, además, como canales iónicos, estableciendo así un grupo denominado icAQPs. Se ha postulado que, en estos canales, la conducción de iones se daría por un poro central conformado por la estructura tetramérica independiente del poro conductor de agua localizado en cada uno de los protómeros. A la fecha son pocos los ejemplos de canales PIP con función de canal iónico y, a pesar de la alta identidad de secuencia entre isoformas, las propiedades de conducción de las PIP son diferentes. En este contexto nos preguntamos ¿Cuáles son los determinantes estructurales que diferencian canales PIP que transportan iones de los que no lo hacen? ¿Cómo es el mecanismo de este transporte y su regulación? Así, este plan tiene como objetivo general abordar el estudio del transporte de iones en canales de la subfamilia PIP poniendo el foco de atención en sus particularidades estructurales y en los mecanismos de regulación que presentan (pH intracelular, fosforilaciones). Durante la realización de este trabajo doctoral se combinan experimentos biofísicos de transporte de agua y de iones en canales PIP nativos y mutantes, con estudios computacionales (análisis bioinformáticos y simulaciones de dinámica molecular atomística) para poder responder las preguntas establecidas. El estudio de las icAQPs es un área emergente de gran interés en el campo de investigación sobre la función general de los canales MIP. La implicancia que puede tener a nivel fisiológico el hecho de que canales PIP transporten iones además de agua puede cambiar la mirada que tenemos sobre el papel de esta familia en diferentes procesos biológicos. Por ello, consideramos necesario realizar estudios estructura-función que permitan entender cómo se da este transporte, cómo se regula y cuáles son las PIP que, efectivamente, cumplen función de canal iónico.Compartir:
Investigación de la Actividad Antitumoral de Partículas Coloidales Esféricas SiO2@Cu y SiO2@CuxOy en Modelos de Cultivo Celular Bi-Tridimencional Autores:Guerra, Emeli Fecha: 01/01/2024Resumen:La síntesis de 1 g de partículas coloidales esféricas con estructura núcleo-cáscara cuyadistribución de diámetros es monodispersa (500 nm) requiere formar una cáscara con un espesor nanométrico en cada una de las aproximadamente 1x10^13 partículas (¡10 billones de partículas!). Un trabajo reciente reportó una síntesis de partículas SiO2@FexOy [1]. Aunque ese trabajo ofrece una síntesis más sencilla y verde que trabajos previos, requiere el uso de etanol absoluto y aprovecha sólo parte del precursor de hierro usado en la construcción de la cáscara nanométrica. En este trabajo, investigamos con un diseño factorial 2^2 la influencia de dos factores (el alcohol usado como solvente y la cantidad de hierro usada como precursor) sobre la formación de las partículas SiO2@FexOy . Investigamos la influencia de reemplazar etanol absoluto por etanol 96° y de cuadruplicar la cantidad de precursor de hierro en la síntesis sobre el diámetro de las partículas formadas.Un diseño factorial implica realizar cuatro síntesis. Cada síntesis se realizó por duplicado. La distribución de diámetros fue calculada a partir de imágenes de microscopía electrónica de barrido con un procedimiento desarrollado ad hoc. Los datos fueron analizados con un ANOVA ( = 0,20) con ayuda del software Infostat [2]. Distribución normal e independiente de los errores, así como igualdad de varianzas fueron comprobados con Q-Q plot y test de Fischer (2 colas, = 0,05), respectivamente.Los resultados obtenidos en este trabajo indican que (a) el cambio de etanol absoluto poretanol 96°, (b) el cuadruplicado de la concentración del precursor de hierro y (c) ambos cambios simultáneos no influyen significativamente sobre el diámetro de las partículas formadas (ANOVA, p-valor gt; 0,20). Estos resultados permiten concluir dos ideas importantes. Primero, podemos usar un solvente mucho más barato en la síntesis sin afectar la formación de la cáscara. Este ahorro es una importante ventaja a la hora de sintetizar. Segundo, la formación de la cáscara parece tener un cuello de botella en su formación que no es la cantidad de hierro disuelto en el solvente. En el solvente de la dispersión permanece una considerable cantidad de hierro.En resumen, este trabajo muestra que es posible abaratar la síntesis de SiO2@FexOy alreemplazar etanol absoluto por etanol 96°. Además, sugiere que la cáscara de Fe x O y se forma con un mecanismo complejo en el cual la concentración de hierro tiene poca influencia sobre el espesor de la cáscara.Compartir:
Desarrollo de procesos biotecnológicos innovadores para la producción de un edulcorante natural y evaluación de sus potenciales aplicaciones en la formulación de alimentos Autores:Castro, Magalí Fecha: 01/01/2024Resumen:En nuestro país el consumo de azúcar es muy superior al recomendado por la OMS. Aunque se han implementado políticas de salud pública para reducirlo, esto ha llevado a un mayor consumo de edulcorantes artificiales, que también pueden presentar efectos adversos. El objetivo de mi Tesis Doctoral es desarrollar un proceso biotecnológico para producción local de un edulcorante natural de origen proteico: la taumatina. Esta proteína tiene un alto potencial tecnólogico pero es un recurso escaso ya que hasta el momento la producción de taumatina recombinante no ha llevado a proceso costo-eficiente. Los objetivos específicos son: 1- Obtener las construcciones para expresar el gen de la taumatina II en Escherichia coli y en la levadura Komagataella phaffi (Pichia pastoris). 2- Expresar el gen de la taumatina en bacterias y obtener un anticuerpo específico. 3- Transformar células de Pichia pastoris y seleccionar colonias que poseen el gen de la taumatina integrado con alta copia del gen. 4- Optimizar la producción de taumatina en la levadura. 5- Desarrollar un protocolo para recuperar la taumatina secretada al medio. 6- Evaluar el poder endulzante de la taumatina producida en levaduras y su estabilidad térmica. 7- Evaluar la utilización de la taumatina recombinante en la formulación de panificados libres de gluten y de golosinas. Este trabajó permitirá generar un proceso costo-efectivo para producir taumatina que un futuro podría ser utilizada por la industria local y también ser exportada. Además, permitirá avanzar en el conocimiento de su utilización en diferentes formulaciones, en particular sujetas a tratamientos térmicos y evaluar el impacto de estos procesos en sus características organolépticas.Compartir:
Surfactantes derivados de aminoácidos: obtención mediante estrategias biocatalíticas y actividad biocida sobre distintas especies de candida Autores:Hermet, Melisa Fecha: 01/01/2024Resumen:Antisépticos y desinfectantes son utilizados a gran escala para el control y prevención de infecciones y eliminación de potenciales contaminaciones microbianas en alimentos y productos de consumo general. La resistencia por parte de bacterias y hongos a biocidas representa una amenaza creciente a la salud pública mundial. Los patógenos fúngicos oportunistas se han convertido en una de las principales causas de mortalidad en pacientes hospitalizados. A nivel mundial, la incidencia de micosis crónicas o graves afecta a casi 5 millones de personas al año. En Argentina, al menos un 2% de la población sufre un episodio de micosis grave al año con una mortalidad del 50%, principalmente en aquellas asociadas a Candida spp. Diversos surfactantes catiónicos se emplean como agentes antimicrobianos, en particular, aquellos derivados de aminoácidos (TAA) mimetizan estructuras naturales y han demostrado poseer baja irritabilidad y toxicidad, buena biodegradabilidad y biocompatibilidad. Al ser obtenidos mediante catálisis enzimática empleando peptidasas, combinan no solo la generación de compuestos biodegradables sino también el uso de tecnologías de producción de bajo impacto ambiental, confiriéndoles numerosas ventajas sobre los tensioactivos sintéticos convencionales. Se ha demostrado la capacidad de inhibir el crecimiento e incluso biocida de estos compuestos, y se considera que actúan a nivel de las membranas celulares, produciendo despolarización, lisis y muerte celular. El objetivo del plan es el estudio del efecto biocida de nuevos surfactantes derivados de aminoácidos obtenidos mediante el empleo de técnicas biocatalíticas a partir de materiales de baja toxicidad e impacto ambiental. La investigación se centra en la determinación de dicha actividad sobre levaduras oportunistas del género Candida y el efecto de los surfactantes sobre los factores de virulencia, haciendo foco particularmente en la elucidación del posible mecanismo biocida de los compuestos obtenidos. Una mayor comprensión del mecanismo de acción de estos compuestos es de particular interés para el desarrollo de nuevos productos biocidas y/o en la optimización de procesos antimicrobianos. De esta manera se espera contribuir a la comprensión de los fenómenos involucrados, colaborando al diseño y desarrollo de moléculas de baja toxicidad, multifuncionales con actividad antimicrobiana de amplio espectro, que puedan incorporarse en formulaciones para su uso en las industrias alimentarias, cosmética o farmacéutica.Compartir:
Caracterización funcional de toxinas Cry-like expresadas por el hongo patógeno de insectos Beauveria bassiana Autores:Preisegger, Lautaro Fecha: 01/01/2024Resumen:Los hongos entomopatógenos son una alternativa atractiva para disminuir o erradicar el uso de insecticidas químicos en programas de control de plagas del agro. Si bien la vía clásica de infección de estos hongos filamentosos es a través de la cutícula, el secuenciado del genoma de algunas especies sugiere que existen vías de infección alternativas a la vía cuticular. Para Beauveria bassiana, se encontraron secuencias homólogas a genes de bacterias entomopatógenas que codifican para toxinas Cry, cruciales en el ciclo infeccioso oral de estos microorganismos. Se cree que la presencia de estos genes permitiría al hongo infectar a sus hospedadores por vía oral sumándose a la ya conocida vía de infección cuticular. Ampliar el conocimiento del sistema hongo-insecto nos permitirá desarrollar mejores estrategias de control de plagas, especialmente para enfrentar plagas como Tribolium castaneum, que liberan benzoquinonas de defensa ante las infecciones fúngicas imposibilitando una penetración fúngica eficaz a través de la cutícula.El objetivo de esta investigación es estudiar el rol de las proteínas BbCry-like en el proceso infectivo de B. bassiana frente a T. castaneum y desarrollar un modelo que permita estudiar la infección oral. Para esto se utilizaron mutantes de deleción de la cepa ARSEF 2860 de B. bassiana para cada uno de los genes Cry-like (ΔBbCry1-6) y sus respectivas variantes de complementación con la deleción restituida. Se evaluó el impacto de estas infecciones en la capacidad infectiva y la tolerancia al estrés de todas las cepas. Se encontró una mortalidad disminuida de T. castaneum frente a las cepas ΔBbCry3, ΔBbCry5 y ΔBbCry6. Asimismo, estas cepas mostraron diferencias significativas en el crecimiento y la esporulacion con respecto a la cepa wild type. Por el contrario las variantes de complementación no presentaron diferencias significativas respecto de la cepa wild type, validando la restitución del genotipo original. Para estudiar la vía de infección oral se propuso como diseño experimental el uso de un formulado encapsulado de conidios fúngicos y harina en alginato. El encapsulado restringe el contacto con conidios únicamente a la ingesta de los mismos combinándolos además con harina. Los encapsulados fueron caracterizados por microscopía de fuerza atómica (superficie) y microscopía confocal (distribución de conidios en la matriz del hidrogel). Los ensayos de alimentación con una cepa fluorescente de B. bassiana permitieron visualizar conidios en el interior del sistema digestivo del insecto. Se propone como próximos pasos cuantificar y localizar las células fúngicas en los distintos segmentos del tracto digestivo del gorgojo. Asimismo, se sintetizaron encapsulados con las cepas mutantes para comprender mejor la función de estas proteínas en las vías de infección alternativas.Compartir:
Dinámica de colonización de Beauveria bassiana durante su establecimiento como endófito en Glycine max Autores:Mochen, Theo Fecha: 01/01/2024Resumen:La producción de soja es la principal actividad agrícola extensiva en Argentina, cuya superficie cultivada ha aumentado drásticamente de 2,1 millones de hectáreas en 1980 a 16 millones en 2023, siendo este el cultivo más importante en las provincias de Buenos Aires, Santa Fe, y Córdoba. Asimismo, la Argentina es el tercer productor de soja a nivel mundial, luego de Brasil y Estados Unidos; y este cultivo es de los de mayor producción en todo el mundo, junto con el arroz, maíz, y trigo.Una de las principales plagas del cultivo de soja son las orugas defoliadoras . Éstas causan daños directos e indirectos en las plantas de soja en estado vegetativo y reproductivo, principalmente por consumo foliar, reduciendo su capacidad fotosintética y afectando rendimientos. La estrategia principal de control de estas plagas es mediante insecticidas químicos, pero este método compromete la inocuidad del producto cosechado y puede aumentar la incidencia de poblaciones de plagas resistentes a plaguicidas.Para evitar estas problemáticas, una alternativa atractiva es el uso del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana, que es capaz de establecerse como endófito en el interior de los tejidos vegetales. Se conoce que B. bassiana incrementa el crecimiento, rendimiento, y poder germinativo de plantas de soja inoculadas, así como la resistencia a insectos plaga. Para introducir B. bassiana artificialmente se utilizó la técnica de inoculación de semillas por adhesión de conidios secos; de este modo se disminuyen potenciales costos y tiempos de inoculación, y se garantiza la presencia de B. bassiana durante los primeros estadios fenológicos de la planta, donde son más susceptibles a plagas.En la presente investigación, se propone avanzar en el conocimiento de la interacción entre el hongo entomopatógeno B. bassiana y la planta de soja; evaluando la capacidad endofítica y bioestimulante de la cepa B. bassiana ARSEF 2860.Para cumplir con los objetivos planteados se utilizaron semillas de soja DM40R16 . Se evaluaron diversos métodos de esterilización de semillas; luego se inocularon las semillas por adhesión, y se evaluaron: la capacidad germinativa de semillas inoculadas in vitro, y los parámetros morfológicos en plantas de soja in vivo frente a las no inoculadas (control). Con el fin de detectar B. bassiana como endófito, se realizaron ensayos de reaislamiento microbiológico a partir de fragmentos de hoja, tallo y raíz. Por último, se comprobó la patogenicidad de cepas recombinantes BbEGFP y BbRFP por comparación con la cepa wild type frente al insecto modelo T. castaneum, obteniendo dos candidatos para ensayos de endofitismo, GFP4 y RFP5.Como próximos pasos se propone evaluar la capacidad endofítica de las cepas recombinantes, y el seguimiento de la colonización fúngica por microscopía de fluorescencia. Asimismo, se planea cuantificar la carga fúngica por qPCR. De este modo, se avanzará en el conocimiento de la dinámica de colonización de B. bassiana endófito en soja.Compartir:
Detección de mutaciones génicas asociadas a la resistencia a insecticidas piretroides en poblaciones argentinas de Aedes aegypti, vector de dengue Autores:Barrera Illanes, Nicolás Alberto Fecha: 01/01/2024Resumen:Aedes aegypti es el principal vector de virus como dengue, zika y chikungunya, enfermedades de gran relevancia sanitaria a nivel mundial. Durante los períodos epidémicos, la principal estrategia de control de este vector se basa en el uso de piretroides, insecticidas que actúan sobre los canales de sodio en los insectos. Sin embargo, el uso prolongado de estos compuestos ha generado resistencia debido a mutaciones en el gen que codifica para el canal de sodio, comprometiendo la eficacia de las medidas de control. Previo a nuestros estudios, se desconocía la prevalencia de estas mutaciones en Argentina; su monitoreo es clave para desarrollar estrategias de manejo de resistencia en las campañas de control. En este trabajo se emplearon dos métodos para detectar mutaciones asociadas a resistencia en A.aegypti: Multiplex High-Resolution Melting (mHRM) y TaqMan. Se recolectaron muestras de 16 municipios de Buenos Aires, que se analizaron para identificar mutaciones en los sitios 1016, 1534 y 410 del gen, que previamente fueron asociados a resistencia a insecticidas en la especie. El estudio evidenció la presencia de estas mutaciones en todo el Área Metropolitana de Buenos Aires, y correlacionó las tasas de dengue con la presencia de alelos asociados a resistencia. Confirmamos que la presión de los piretroides ha impulsado el surgimiento y expansión de las mutaciones 1016Ikdr, 1534Ckdr y 410Lkdr en Buenos Aires, lo que indica un problema creciente de resistencia a piretroides en A. aegypti. Estos hallazgos son un insumo para el diseño de políticas públicas de control de vectores basadas en evidencia, y subrayan la necesidad de encontrar métodos sostenibles que complementen o sustituyan el uso de piretroides.Compartir:
Potencial endofítico de Beauveria Bassiana en soja: Perfiles de expresión génica en las interacciones hongo-planta-chinches fitófagas plaga de ese cultivo Autores:Espín Sánchez, Daysi de Lourdes Fecha: 01/01/2024Resumen:En Argentina, el cultivo de soja (Glycine Max) es la actividad agrícola a gran escala más importante y la principal generadora de divisas. Sin embargo, una de las mayores amenazas durante la etapa de fructificación son las poblaciones de chinches plaga que afectan el rendimiento y calidad de las semillas. Entre las especies de chinches más abundantes en la soja del país se encuentra Edessa meditabunda. Cuando se requiere realizar el control de plagas en cultivos extensivos, se usan exclusivamente pesticidas químicos. En este contexto, surge como alternativa atractiva el empleo de hongos entomopatógenos, ya que no generan fenómenos de resistencia ni producen residuos nocivos. Se ha demostrado que el hongo entomopatógeno B. bassiana inoculado a plantas de soja, aumenta la capacidad germinativa de las semillas y mejora el crecimiento y rendimiento de la planta. La ventaja de usar endófitos entomopatógenos es que además de ser bioestimulantes del cultivo, actúan como biocontroladores de insectos. El objetivo de esta investigación es contribuir a responder preguntas básicas de la biología de los sistemas hongo-planta y hongo-insecto, así como realizar avances cognitivos que permitan desarrollar estrategias específicas y exitosas de control microbiano de chinches fitófagas plaga en cultivos de soja.Para estudiar la dinámica del endofitismo de B. bassiana en soja, el hongo fue inoculado por aspersión foliar a plantas en crecimiento. Se estableció que la mayor colonización se da en hoja, entre los 7 y 14 días post-inoculación. Asimismo, con el propósito de determinar el nivel de expresión génica de B. bassiana cuando interacciona con la planta, se extrajo ARN total de hojas de soja endofitada y soja control. Estas muestras se secuenciaron mediante RNAseq dual, encontrando 461 genes diferencialmente expresados. Estos genes se asocian principalmente con la síntesis y regulación de hormonas vegetales, y regulación de la fotosíntesis.Por otra parte, para conocer la dinámica de la infección fúngica en la chinche E. meditabunda, se colocaron insectos adultos con plántulas de soja endofitada, y soja control. Si bien no se observó una mortalidad aumentada en las chinches alimentadas con plantas tratadas, sí se registraron diferencias en la fertilidad de estas respecto de los controles. Para continuar con el estudio de los perfiles de expresión génica de chinches infectadas con B. bassiana se realizará la secuenciación del ARN extraído a partir de intestino de chinches alimentadas con soja endofitada.Finalmente, se propone realizar el seguimiento de la colonización del hongo infectando plantas y chinches con una cepa fúngica recombinante que exprese proteínas fluorescentes, de modo que los tejidos de los hospederos puedan ser evaluados mediante microscopía. Estos resultados permitirán avanzar en el conocimiento de la interacción hongo-planta-insecto, y contribuirán al diseño de estrategias más efectivas de control de plagas del agro.Compartir:
Función de Me31b y eIF4E en la regulación de la traducción Autores:Bianchi Coletta, Micaela Fecha: 01/01/2024Resumen:La regulación de la expresión génica involucra diversos mecanismos, parte de la regulación postranscripcional involucra focos citoplasmáticos formados por agregados ribonucleoproteicos (mRNPs). Entre los componentes conservados encontramos a una helicasa de ARN, Me31B en Drosophila melanogaster (Dm) y al factor de traducción eIF4E (4E). Me31B participa en las vías de degradación del ARNm mientras que 4E es un factor de inicio de la traducción que además participa en la represión de la misma cuando interactúa con Me31B. A. morenensis (Amo) es un plecóptero estenotérmico que habita los glaciares patagónicos y no sobrevive la congelación ni temperaturas mayores que 15°C, por lo que es un fascinante sistema de estudio de los mecanismos moleculares de regulación de la traducción en frío. Resultados previos del grupo demostraron que el ortólogo de Me31B (Amo-Me31B) está altamente conservado, mientras que el análisis del único ortólogo de 4E encontrado en el transcriptoma (Amo-eIF4E) mostró varias sustituciones de aminoácidos que, junto al modelado in silico, muestran su semejanza al ortólogo no canónico eIF4E8 de Dm. Así mismo, demostramos que Me31B interactúa con 4E1 y 4E3 a través de sitios específicos para cada isoforma. Por ello, proponemos evaluar en profundidad los dominios de interacción entre Me31B y 4E y extender nuestros análisis a los ortólogos de Amo evaluando posibles cambios evolutivos relacionados con la temperatura.Para evaluar las interacciones se clonaron los fragmentos de Me31B salvaje y mutante, correspondientes al sitio de interacción con las isoformas de 4E y los ortólogos en Amo. Las interacciones se evaluarán in vitro mediante pull-down e in vivo en levadura y células S2R+. Las secuencias de las proteínas clonadas en pET-SUMO se transformaron en bacterias E. coli BL21(DE3) para expresar las proteínas recombinantes, se purificaron con columna de Ni+2 en ÄKTA start y con nanopartículas magnéticas.Mediante ensayos de doble híbrido se espera determinar los aminoácidos específicos que participan en la interacción entre Me31B y 4E y a su vez si la interacción se mantiene en Amo. Actualmente se mandaron a secuenciar los clonados en pOBD2 y pGAD424 y se está poniendo a punto la concentración necesaria de 3-AT que inhibe la expresión basal de His.Se expresarán las proteínas de fusión fluorescentes mediante la transfección de las células con los clones en pDsRed1-N1 y pEGFP-N1, se evaluará la localización celular de las proteínas. A su vez, se analizará si los mutantes de Me31B que no interactúan con 4E modifican su localización en mRNPs y si colocalizan con 4E1 y 4E3. La localización de las proteínas de Amo se evaluará entre 25 y 14ºC, temperaturas a las cuales las S2R+ están adaptadas y que permitirán acercarse a las condiciones de vida del insecto. Esperamos poder contribuir en explicar los mecanismos de regulación de la traducción de ARNm donde isoformas de eIF4E forman mRNPs diferentes usando distintos dominios de interacción.Compartir:
Asociación entre parámetros bioquímicos y el polimorfismo rs174547 del gen FADS1 en población adulta residente en tres ciudades de la provincia de Buenos Aires con riesgo elevado de desarrollar diabetes mellitus tipo 2 Autores:Olmedo, Luciana Fecha: 01/01/2024Resumen:Introducción: La diabetes mellitus tipo 2 (DM2) es una enfermedad multifactorial que se desarrolla por la interacción compleja entre factores genéticos y ambientales diversos. Entre los factores genéticos, el polimorfismo rs174547 T/C del gen FADS1 se ha asociado con un mayor riesgo de desarrollar síndrome metabólico y DM2, aunque los hallazgos dependen de la población en estudio. El gen FADS1 codifica para la enzima Δ5 desaturasa, implicada en la síntesis endógena de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga a partir de precursores esenciales. El alelo C se ha asociado con una menor actividad de la enzima, y consecuentemente con una disminución de la síntesis endógena de ácido araquidónico (ω-6), acido eicosapentaenoico y docosahexaenoico (ω-3). Objetivos: Estudiar la posible asociación entre esta variante genética con parámetros bioquímicos en una población con riesgo elevado de desarrollar DM2. Materiales y Métodos: La población en estudio corresponde a un total de 164 adultos de ambos sexos, con un riesgo incrementado de desarrollar DM2 (puntuación ≥13 en el cuestionario FINDRISC), previamente reclutados en el estudio PPDBA en 3 municipios de la provincia de Buenos Aires. Al inicio del reclutamiento se realizó una evaluación bioquímica en la que se recogieron las variables glucemia en ayunas, glucemia postprandial, hemoglobina glicosilada (HbA1c), creatinina basal, triglicéridos, colesterol total, HDL-colesterol y LDL-colesterol. Además, se extrajeron muestras de ADN a partir de las cuales se obtuvieron los genotipos para el SNP en el gen FADS1 mediante qPCR utilizando sondas Taqman. La asociación entre los genotipos y los parámetros bioquímicos se realizó mediante modelos lineales multivariados (ANCOVA y regresión lineal múltiple) y regresión logística multivariada. Las variables de ajuste utilizadas fueron edad, sexo, nivel de actividad física y hábito tabáquico. Resultados: Las frecuencias genotípicas obtenidas fueron de 38,4%, 37,8% y 23,8% para CC, CT y TT respectivamente. La probabilidad de tener un nivel de HbA1c ≥5,7% fue 3,6 veces mayor para los homocigotas TT en comparación con los homocigotas CC (OR: 3,6, IC 95%: 1,1-12,5, p= 0,035). Adicionalmente, los homocigotas TT tuvieron mayores niveles de creatinina en comparación con los homocigotas CC (CC=0,73 mg/dl vs. TT= 0,83 mg/dl, P=0,022). Aunque se observaron tendencias, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas para glucemia en ayunas, glucemia postprandial, y perfil lipídico entre genotipos. Conclusiones: El genotipo rs174547 para el gen FADS1 se asocia con el estado de prediabetes en la población en estudio.Compartir:
Biomateriales implantables para la regeneración de tejido óseo Autores:Bonifacio, Nahuel Fecha: 01/01/2024Resumen:INTRODUCCIÓNLa ingeniería de tejido óseo utiliza andamios que actúan como una matriz extracelular para permitir el desarrollo del tejido de reparación.Durante la reparación del hueso endocondral, los condrocitos secretan factores propios (Sox9, colágeno 2 y aggrecan) y angiogénicos (HIF1a y VEGF). Estos últimos, promueven la invasión y generación de capilares necesarios para la remodelación tisular.La interdependencia entre la formación de un callo óseo, su vascularización y el reemplazo por tejido óseo maduro hace que estos pasos sean críticos durante la reparación de las lesiones óseas.El objetivo de este trabajo es evaluar la diferenciación de condrocitos primarios sobre una matriz polimérica compuesta de quitosano, carboximetilceluosa y nanohidroxiapatita (BioQCH), y su posible rol en el proceso de angiogénesis.MATERIALES Y MÉTODOSObtención de la matriz poliméricaSe realizó según una metodología previa: mezclando 0.5% de nanohidroxiapatita con un 1% p/v de kitosano en 0.25 P/v de ácido acético. Se goteo 1% p/v de carboxilmetilcelulosa bajo agitacion (150 rpm) y luego liofilizado a peso constante.Producción de glucosaminoglicanos (GAGs)Los condrocitos se cultivaron sobre la matriz (21 días) y se evaluó la producción de GAGs. Las células fijadas se tiñeron con azul alcian (pH 3,5; 12h), y el material teñido disuelto en DMSO se determinó a 570 nm.Marcadores moleculares de diferenciación condrogénicaSe aisló el ARN total de condrocitos cultivados por el método TRIZOL. La expresión de ARN de marcadores condrogénicos (colágeno tipo II -Col2-, aggrecan y SOX9) se analizó mediante RT-PCR semicuantitativa y se normalizaron utilizando β-actina como housekeeping, empleando el programa MBF_ImageJ con el plugin para geles. RESULTADOS Y DISCUSIÓNAl evaluar el fenotipo de los condrocitos creciendo en el biomaterial o en la placa de cultivo de tejidos (C, empleada como control) en ambos casos encontramos que secretan niveles similares de GAGs. Al estudiar la expresión de los marcadores moleculares de condrocitos SOX9 y aggrecan, no encontramos diferencias significativas, mientras que col2a se expresó en mayor medida (plt;0,01) en condrocitos creciendo sobre la membrana BioQCH. Mediante análisis de PCR, encontramos que los condrocitos que crecían en la matriz o en una placa de cultivo de tejidos expresaban dos factores angiogénicos, HIF1a y VEGF. De estos últimos, VEGF fue significativamente mayor en los condrocitos que crecieron en condiciones de control que en los que crecieron en el biomaterial. CONCLUSIONESLa membrana BioQCH promueve la formación de cartílago mediante la secreción de GAGs y marcadores moleculares (SOX9, aggrecan y col2), pudiendo estimular el proceso de angiogénesis mediante la secreción de factores HIF1a y VEGF.Compartir:
Biomateriales implantables para la regeneración de tejido óseo Autores:Gonzalez, Sebastian Fecha: 01/01/2024Resumen:INTRODUCCIÓN Durante la formación y reparación del hueso endocondral, los condrocitos desempeñan un papel crucial en la promoción de la angiogénesis al secretar factores angiogénicos, como HIF1a y VEGF, que a su vez promueven la invasión y generación de capilares necesarios para la remodelación ósea¹. Nuestra evidencia indica que los condrocitos, al crecer sobre biomateriales de relleno, secretan HIF1a y VEGF. El presente trabajo evalúa si los productos de la diferenciación de condrocitos en la matriz polimérica a base de quitosano, carboximetilcelulosa y nanohidroxiapatita, previamente sintetizada y caracterizada en nuestro grupo² modifican aspectos relevantes de la angiogénesis como la migración, formación de anillos, nodos y ramificaciones de células endoteliales.MATERIALES Y MÉTODOSEnsayos de migración La monocapa confluente de células endoteliales EAhy269 se rascó mecánicamente usando una punta de pipeta P200 y el medio de cultivo se reemplazó por DMEM sin rojo de fenol, agregándole 50 o 100 µl de medio condicionado de condrocitos creciendo sobre los biomateriales (BioQCH). Después de 4 horas la monocapa celular se fijó y se tiñó con cristal violeta. Las microfotografías se analizaron midiendo la distancia de migración desde los bordes de la herida; se cuantificó utilizando el software Image J.Ensayos de angiogénesis Evaluamos la capacidad angiogénica de medios condicionados a partir de condrocitos control (C) o de crecimiento sobre biomateriales (BioQCH). Se sembraron células EAhy269 en placas de cultivo cubiertas con colágeno tipo 1. Luego, se agregaron 50 o 100µl de medio condicionado (C o BioQCH) durante 24hs. Las micrografías se analizaron con el software ImageJ utilizando una escala de microscopio adecuada. Se evaluaron el número y perímetro de los anillos, el número de nodos y la longitud de las ramas por nodo.RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para el ensayo de migración la cicatrización positiva de la herida se puede observar como una menor distancia entre los bordes, indicativo de migración celular hacia el centro de ésta. En nuestro experimento, encontramos que 100µl de medio condicionado BioQCH estimuló la cicatrización de heridas disminuyendo la distancia entre los bordes en un 38±1% con respecto a la condición control que lo hizo en un 23±0,5%. La coincubación de las células EAhy269 con 100 ul de medio condicionado de condrocitos cultivados en BioQCH disminuyó el número de anillos, en comparación con la condición de control ; mientras que aumenta el perímetro del anillo. Además, 100 ul de medio condicionados BioQCH disminuye la cantidad de nodos, pero provoca un aumento en la longitud de ramificación de los tubos por nodo. CONCLUSIONES A partir de los resultados obtenidos podemos concluir que los condrocitos que fueron madurando sobre el biopolímero secretan factores que estimulan la migración de células endoteliales, así como la angiogénesis; aunque los anillos son de mayor tamaño y menor número.Compartir:
Estrategias reproductivas de moluscos gasterópodos. Rol de las toxinas de huevos de caracoles invasores y plaga de cultivos Pomacea (Caenogastropoda: Ampullariidae) en las defensas frente a insectos y otros invertebrados Autores:Soldati, Kevin Brian Fecha: 01/01/2024Resumen:Los caracoles dulceacuícolas del género Pomacea, son Gasterópodos nativos de América con una estrategia reproductiva peculiar, depositan sus huevos calcáreos y pigmentados en la vegetación emergente, exponiéndolos a todo tipo de depredadores. Sin embargo, estos huevos prácticamente carecen de depredadores, lo que se asocia con la presencia de un eficiente sistema de defensa bioquímico. Las especies del género Pomacea se agrupan en cuatro clados bien soportados, siendo el más numeroso y el más derivado el clado canaliculata, donde se encuentran P. canaliculata y P. maculata. Estas especies, fueron introducidas principalmente en el sudeste asiático, donde se han convertido en importantes plagas del agro y han alterado la dinámica de ecosistemas acuáticos. Por el contrario, otras especies más basales del género, como P. scalaris que pertenece al clado bridgesii, posee una distribución más limitada, y aunque han sido introducidas en otras regiones no han logrado adquirir un carácter invasor. Estos caracoles depositan huevos con una coloración que varía del rosa pálido en los clados más basales, hasta un rojizo-anaranjado en el clado canaliculata. En el clado canaliculata se aisló y caracterizó una potente neurotoxina/enterotoxina proteica llamada PV2, ausente en los demás clados. Esta toxina, que forma parte del fluido perivitelino (FPV) que rodea al embrión, ha sido caracterizada en cuanto a su estructura y toxicidad empleando modelos de vertebrados, en particular roedores. Por el contrario, en el clado bridgesii se han aislado y caracterizado potentes lectinas enterotóxicas. Entre ellas se destaca PsSC, la lectina de P. scalaris, con capacidad para reconocer oligosacáridos de membrana y afectar reversiblemente la morfofisiología del intestino de los ratones que la ingieren. Si bien sólo PV2 es neurotóxica y letal si se inyecta, tanto ésta como PsSC provocan, aunque de manera diferente, alteraciones morfofisiológicas sobre el intestino delgado. Esto, junto a otros resultados sugieren que estas defensas son clado-específicas y que podrían contribuir al éxito reproductivo e invasividad de estas especies. Sin embargo, su potencial rol anti depredador aún no ha sido estudiado en ningún invertebrado. El objetivo general de este proyecto es estudiar la toxicidad, efectos sobre el ciclo de vida y posibles alteraciones en la morfofisiología intestinal de huevos de Pomacea sobre este grupo, empleando coleópteros Tenebrio molitor, plaga del agro de nuestro país, como modelo de potencial depredador. Asimismo, se estudiará un representante de los nematodos, focalizando el estudio en Caenorhabditis elegans. Esta especie es además un organismo modelo exhaustivamente estudiado y muy utilizado en ensayos de toxicidad.Compartir:
Desarrollo de nuevos metalofármacos de cobre(II) e hidrazonas con potencial actividad antitumoral para el tratamiento del cáncer de mama triple negativo Autores:Santa Maria de la Parra, Lucía Fecha: 01/01/2024Resumen:El cáncer de mama es el tipo de cáncer más común entre las mujeres, representando el 32,1% de los casos en Argentina. El cáncer de mama triple negativo (TNBC) es un subtipo agresivo de cáncer de mama caracterizado por una alta invasividad, un alto potencial metastásico, propensión a la recaída y un mal pronóstico. En consecuencia, desarrollar estrategias terapéuticas innovadoras para el TNBC se ha vuelto esencial para la práctica clínica.Por tal motivo, el objetivo de mi tesis doctoral es sintetizar y caracterizar los compuestos de Cobre(II) con ligandos de interés biológico y/o farmacológico, y estudiar la actividad biológica delos mismos en sistemas in vitro en 2D (células en cultivo) y en modelos complejos 3D (esferoides tumorales), incluyendo estudios de toxicidad y de los posibles mecanismos de acción.En relación a los ligandos a utilizar en este estudio, un grupo de compuestos interesantes por sus propiedades y por sus nuevas aplicaciones son las hidrazonas y sus derivados. Esta familia de ligandos presenta compuestos con una gran versatilidad en sus propiedades de coordinación con metales, lo cual determina entre otras cosas su variada gama de aplicaciones.Entre los avances de mi tesis, demostramos la potencia anticancerígena de nuestro complejo de Cu(II) más recientemente sintetizado y reportado derivado de acilhidrazona, [Cu(N−N−Fur)(NO3)(H2O)] (CuHL1), en un panel de líneas celulares humanas de TNBC con características distintivas (MDA-MB-231, MDA-MB-157, MDA-MB-468 y HCC1806). CuHL1 mostró un efecto citotóxico altamente significativo en todas las células probadas, con valores de IC50 entre 1,5 y 2,7 µM a las 24 h de tratamiento. Se realizaron análisis adicionales en células MDA-MB-231 para revelar el mecanismo de acción del complejo. CuHL1 produjo un incremento de las especies reactivas de oxígeno (EROs) a partir de 1 µM luego de 3 h de incubación. Este complejo también indujo la muerte celular por apoptosis, demostrado por un aumento de células apoptóticas tempranas a 1 µM y un incremento de células apoptóticas tardías a 1 y 2,5 µM después de 24 h de tratamiento. Finalmente, se realizó un análisis proteómico mediante label-free quantification utilizando el Orbitrap LC-MS/MS (Thermo ScientificTM, Waltham, MA, EE.UU.). Entre las 34 proteínas diferencialmente expresadas, 19 fueron reguladas positivamente y 15 negativamente por el tratamiento con 1 µM de CuHL1. Es interesante remarcar que BCAR3 (Breast cancer anti-estrogen resistance 3) se encontró regulado negativamente, dado que se ha reportado previamente que su alta expresión en TNBC, se correlaciona con peores resultados y efectos de quimiorresistencia en los pacientes. Aunque sería necesario realizar otros ensayos proteómicos para validar nuestros resultados, CuHL1 se posiciona como un candidato prometedor para potenciales terapias anti-TNBC y sería interesante probar este complejo en estudios in vivo.Compartir:
Tratamiento con metformina como estrategia para la prevención de calcificaciones vasculares asociadas al sindrome metabólico experimental Autores:Streckwall, Lucas Fecha: 01/01/2024Resumen:El Síndrome Metabólico (SM) se define por insulino-resistencia, hiperglucemia, dislipemia, hipertensión arterial y/u obesidad central. El SM aumenta el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares debido, en parte, a una rigidización vascular por acumulación de calcificaciones arteriales (CA) producto de una transdiferenciación osteogénica de células de músculo liso vascular (CMLV). El fármaco metformina (MET) parece prevenir dicha transdiferenciación in vitro. El objetivo general del proyecto es evaluar la eficacia de la MET oral para prevenir la predisposición a formar CA en un modelo de SM experimental inducido por Fructosa en ratas, estudiando mecanismos involucrados.Para ello, ratas Wistar macho fueron divididas inicialmente en 2 grupos: uno recibió agua como fuente de bebida, y el otro una solución de fructosa al 20%. Tras 2 semanas, se agregó a la mitad de cada grupo MET 100 mg/kg/día a la fuente de bebida, continuando así por 4 semanas más, formando los grupos: C (agua), F (fructosa 20%), M (MET 100 mg/kg/día) y FM (F+MET).Pre-eutanasia, se pesaron los animales y se obtuvieron muestras séricas para análisis del estado metabólico y evaluación de fructosamina como marcador de glicación extracelular. Post-eutanasia, se diseccionó el tejido adiposo y aorta, cuya porción abdominal fue usada para análisis histológico de la pared arterial. El cayado aór¬tico se usó para un ensayo de calcificación incubándolo una semana en medio de diferenciación osteogénico; en el caso de los grupos C y F, esto se realizó en presencia o ausencia de MET en el medio; para luego extraer y cuantificar el calcio. De la aorta toracoabdominal se aislaron y cultivaron CMLV para evaluar su actividad de Fosfatasa alcalina (FAL), producción de Colágeno tipo I (Col), mineralización extracelular (Min) y expresión génica de Runx2 y receptor para AGEs (RAGE).Se observó un aumento significativo de adiposidad mesentérica, glucemia, trigliceridemia, relación TG/HDLc y fructosamina en F, siendo compatible con el desarrollo de SM. En la pared aórtica, F presentó una disminución significativa en la relación membrana elástica/capa muscular y una mayor área cubierta por colágeno, efectos prevenidos por MET oral. En los ensayos de calcificación, los cayados aórticos de animales expuestos sólo a fructosa mostraron tendencia a una mayor calcificación, mientras que MET disminuiría dicho efecto tanto in vivo como in vitro. Las CMLV del grupo F presentaron un aumento de FAL junto a una tendencia a mayor producción de Col y Min; a la vez que un aumento en la expresión de Runx2 y RAGE. Todos estos efectos sobre CMLV fueron prevenidos por MET oral.En conclusión, el SM inducido por fructosa induce alteraciones estructurales en la túnica media aórtica y aumenta la transdiferenciación osteogénica de sus CMLV, posiblemente a través de una mayor expresión y activación del RAGE. Estos efectos pueden ser prevenidos por un tratamiento oral con MET.Compartir:
Caracterización genómica de razas bovinas criollas de Argentina y Bolivia Autores:Marcuzzi, Olivia Fecha: 01/01/2024Resumen:Se estudiaran muestras de poblaciones de Ganado Criollo de Argentina y Boliviana. El ADN genómico se extraerá a partir de las muestras de sangre mediante extracción orgánica o utilizando el kit comercial Wizard® Genomic DNA Purification (Promega, USA). El ADN será genotipado mediante los microarrays de SNPs Axiom™ Bos 1 Genotyping Array r3 (Affymetrix, CA, USA), que contiene 648,855 SNPs, y el ArBos 1 (Affymetrix), que incluye 58,088 SNPs, utilizando la plataforma GeneTitan™ (Affymetrix). Los datos crudos serán procesados usando el software Axiom™ Analysis Suite (Affymetrix) y los datos procesados serán exportados en formato .PED y .MAP. La posición de los marcadores será asignada según la versión del genoma bovino UMD 3.1. A partir de la información obtenida de los microarrays, se construirá una matriz de genotipos única con los SNPs comunes utilizando la función –merge del programa Plink versión 1.9 (Purcell et al., 2007). Para la evaluación la variabilidad genética se estimarán los niveles de heterocigosidad esperada (He) para cada locus y el coeficiente de consanguinidad mediante el estadístico FIS en cada una de las poblaciones, así como mediante la identificación de regiones de homocigosidad (ROH) para los polimorfismos contenidos en ellas. Además, se estimará la matriz de parentesco. Para evaluar la estructura poblacional, se estimarán las relaciones entre los animales de cada raza muestreada se realizará un análisis de componentes principales (PCA) implementado en Plink v1.9 utilizando la matriz de genotipos, y los resultados obtenidos serán graficados con el paquete de R ggfortify package in R (Tang et al., 2016). Por otra parte, se estimarán las distancias genéticas entre las razas y se construirán los árboles filogenéticos utilizando los softwares PEAS V1.0 (XU, GUPTA, JIN 2010) y visualizaran utilizando TREEVIEW (Page, 1996). El análisis de composición genética y el grado de mezcla se estimarán mediante el análisis de clúster implementado en el programa FastStructure (Raj et al., 2014). Los resultados obtenidos se visualizarán mediante el paquete de R pophelper R (Francis, 2017). Para la detección de huellas de selección en las poblaciones de bovinos criollos adaptados a diferentes ambientes se utilizarán los estadísticos XP-EHH (Extensión de homocigosidad haplotípica entre poblaciones) y REHH (Homocigosidad relativa de haplotipo extendido) (Sabeti et al., 2002, 2006; Voight et al., 2006). Para ello se determinarán inicialmente las fases haplotípicas usando el software ShapeIT v4 (Delaneau et al., 2019). Con el fin de identificar los genes localizados en las regiones detectadas por los métodos de huellas de selección, las posiciones serán transformadas a la versión del genoma ARS-UCD1.2, ya que tiene una más completa anotación que la versión UMD3.1.Compartir:
